Le kit d’enrichissement en lysosomes Thermo Scientific™ pour cellules de tissus et en culture permet l’isolement et l’enrichissement des lysosomes intacts à partir d’extraits de cellules et de tissus bruts. Le kit fournit suffisamment de réactifs pour préparer 25 extraits et utilise des milieux de séparation de cellules OptiPrep pour la séparation basée sur la densité des lysosomes à partir de structures cellulaires contaminantes. Les lysosomes isolés peuvent être utilisés pour un certain nombre d’applications en aval, y compris la 2D / MS pour la recherche en protéomique, la microscopie électronique, le profilage de maladies et l’expression génétique, la transduction de signal, l’interaction ou la localisation.

Caractéristiques du kit d’enrichissement en lysosomes pour cellules de tissus et en culture :

• Efficace et facile d’utilisation : les réactifs du kit et la centrifugation en gradient séparent les organites des structures de contamination
• Compatible : préparation des échantillons pour des applications en aval, notamment la 2D / MS, la microscopie électronique, le profilage de maladies, l’expression génétique, la transduction de signal et les études d’interaction ou de localisation
• Complet : les kits contiennent suffisamment de matériel pour 25 applications

Ce kit permet l’enrichissement d’organites intacts à partir de cellules et de tissus. Chaque kit utilise une centrifugation en gradient de densité afin de séparer les organites des structures cellulaires contaminantes. Les organites isolés peuvent être utilisés pour un certain nombre d’applications en aval, y compris les études 2D / MS, la microscopie électronique, le profilage de maladies, l’expression génétique, la transduction de signal et les études d’interaction ou de localisation.

Enrichissement des organites à partir de tissus :
des rats Sprague-Dawley femelles âgées de six à huit semaines, d’un poids moyen de 160 g, ont été à jeun pendant la nuit avant le sacrifice. Le foie et les reins ont été excisés, lavés avec du PBS glacé, hachés à l’aide de ciseaux chirurgicaux, puis homogénéisés dans le réactif A glacé à l’aide d’un homogénéisateur de dispersion de tissus Polytron™ pendant 45 secondes à 8 000 tr / min. Le réactif B a ensuite été ajouté et l’homogénat a été centrifugé pour éliminer les débris cellulaires. Le surnageant résultant a été superposé sur un gradient discontinu de milieux de séparation cellulaire OptiPrep™ et centrifugé pour isoler et enrichir l’organite cible. La bande cible a été retirée du gradient et analysée par transfert Western.

Enrichissement des organites à partir de cellules :
plusieurs lignées cellulaires ont été examinées pour l’isolement du lysosome : A431 [American Type Culture Collection (Centre de ressources ATCC™), #CRL-1555], HeLa (ATCC, #CCL-2) et HepG2 (ATCC, #HB-8065). Les cellules ont été cultivées à 80 à 90 % de confluence. Environ 50 à 200 mg de pâte cellulaire humide a été récoltée et traitée pour l’enrichissement du lysosome. Le réactif A lysosome glacé a été ajouté aux cellules et la lyse a été effectuée à l’aide d’un sonicateur Misonix 3000 avec 15 impulsions fournissant 15 W de puissance.

Par la suite, le réactif B lysosome a été ajouté et l’homogénat a été centrifugé pour éliminer les débris cellulaires. Le surnageant résultant a été superposé sur plusieurs gradients discontinus des milieux de séparation cellulaire OptiPrep et centrifugé pour isoler et enrichir l’organite cible. La bande cible a été retirée du gradient et, avec le lysat total, normalisée par la quantité de protéines (sauf indication contraire) et analysée par transfert Western.

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