Pierce™ Protein Refolding Kit

Le kit Thermo Scientific Pierce pour le repliement des protéines contient des réactifs ultra-purs et des instructions détaillées permettant l’utilisation d’une stratégie matricielle afin de déterminer les conditions de tampon optimales pour le repliement de protéines recombinantes qui ont été dénaturées et solubilisées à partir de corps d’inclusion.

Caractéristiques du kit pour le repliement des protéines :

• Robuste : les conditions et les composants examinés sont limités à ceux qui présentent l’utilité générale la plus significative en tant que tampons de repliement
• Pratique : la conception matricielle à trois niveaux réduit significativement les procédures d’optimisation secondaires requises et facilite l’interprétation des données
• Format de matrice ajustable : permet de personnaliser les expériences de repliement en fonction de la protéine cible ; les interactions positives et négatives connues entre les composants du tampon sont identifiées, ce qui minimise les analyses non nécessaires
• Réactifs ultra-purs : les réactifs sont formulés selon des normes strictes afin d’obtenir des résultats systématiques

Le kit contient les réactifs essentiels et la stratégie complète qui permettent de déterminer les conditions de tampon optimales pour le repliement de protéines recombinantes dénaturées afin de rétablir leur structure et leur fonction natives. Neuf tampons de repliement basiques forment une matrice qui comprend diverses conditions dénaturantes fortes et faibles afin de supprimer l'effet d'agrégation des protéines. Les additifs fournis sont utilisés en tant que facteurs matriciels supplémentaires, en fonction du type de protéine repliée. Les composants du tampon sont examinés à trois niveaux de concentrations, ce qui permet de tester un vaste spectre de conditions de repliement en une seule expérience. La conception modulable permet d'ajuster les conditions matricielles en fonction de la protéine cible, ce qui permet d'éliminer les pertes d'échantillon et les analyses non nécessaires tout en maximisant l'efficacité du repliement. Le kit pour le repliement des protéines Pierce s’accompagne d’un guide de repliement complet, qui présente des détails sur l’isolement, la solubilisation et la purification des corps d’inclusion ; l’optimisation des conditions de repliement ; et l’analyse de l’efficacité du repliement.

Remarque : La section suivante est basée sur l’article de Previews d’origine, qui a rapporté le développement du kit pour le repliement de protéines Pierce, initialement appelé “Pro-Matrix”.

Méthodes
Le lysozyme a été dénaturé pendant la nuit à 4°C dans 8 M de GdnHCl, 10 mM de DTT, 50 mM de Tris, pH 8,0 à 20 mg / ml. Le glutathion réduit, le glutathion oxydé et le DTT ont été ajoutés aux tampons de repliement comme déterminé par la disposition de la matrice (tableau 3). Toutes les solutions ont été équilibrées à 4°C. Immédiatement avant d’ajouter le lysozyme solubilisé aux tampons de repliement, le DTT a été retiré à l’aide d’une colonne de centrifugation de dessalage protéique et équilibré dans 8 M de GdnHCl, 50 mM de Tris ; pH 8,0. Le lysozyme a ensuite été ajouté aux tampons de repliement à une concentration finale de 1 mg / ml. Cet ajout fournit 0,4 M de GdnHCl aux tampons de repliement de base. Le repliement a été autorisé pour le traitement pendant 18 heures à 4°C. Les rendements du repliement ont été déterminés en mesurant l’activité des lysozymes avec le kit d’analyse du lysozyme EnzChek(tm) (Molecular Probes) à l’aide d’un système Tecan(tm) SPECTRAFluor Plus.

Résultats et discussion
Le protocole de base pour le repliement des protéines exige que les corps d’inclusion soient d’abord isolés, purifiés puis solubilisés avec un dénaturant puissant, tel que le chlorhydrate de guanidine (GdnHCl), pour produire une protéine complètement dépliée. La protéine solubilisée est ensuite diluée ou dialysée dans un tampon de repliement afin de réduire la concentration du dénaturant, ce qui permet à la protéine de se replier en fonction des informations contenues dans sa séquence primaire. Dans des conditions optimisées, de nombreuses protéines peuvent être repliées de manière fiable à des concentrations de > 1 mg / ml. Cependant, si le dénaturant est retiré et remplacé par un tampon de repliement non optimisé, l’agrégation de protéines est en concurrence forte avec la renaturation et seules des quantités minimales de protéines natives sont récupérées. Le degré d’agrégation qui se produit pendant le repliement dépend en grande partie de la concentration protéique, de la concentration de dénaturants puissants et faibles, du pH, de la température et de l’environnement redox. La force ionique, les cations divalents, les polymères et les cofacteurs peuvent également favoriser la renaturation de certaines protéines.

Le tableau 3 présente les résultats obtenus suite à la renaturation du lysozyme réduit et dénaturé à l’aide du kit de renaturation de protéines Pierce. Pour cet exemple, nous avons traité le lysozyme en ignorant la présence de ponts disulfure à l’état natif. La reformation du lysozyme natif a été inhibée aux concentrations dénaturantes les plus faibles et les plus élevées présentes dans le modèle de repliement des protéines (essais numéros 1, 2 et 9). Le repliement a également été inhibé par la présence de DTT (essais numéros 1, 6 et 8) et démontre ainsi l’importance de la reformation de ponts disulfures lors du repliement du lysozyme. L’activité la plus forte du lysozyme récupérée dans l’expérience a été obtenue dans l’essai 7, qui contenait 1,4 M de GdnHCl, 0 M de L-arginine, 2 mM de GSH : 0,4 mM de GSSG, et représente plus de 90 % du lysozyme solubilisé en cours de repliement.