Gibco™

Bac-to-Bac™ HBM TOPO™ Cloning Kit

Kit de clonage Bac-to-Bac™ HBM TOPO™

Référence	Nbre de réactions
A11338	20 réactions

Référence A11338

Prix (EUR)

Nbre de réactions:

20 réactions

L’expression du baculovirus Bac-to-Bac™ est une méthode efficace pour produire du baculovirus pour l’expression de protéines de haut niveau dans les cellules d’insectes. Elle repose sur la génération de virus recombinant par transposition spécifique au site dans l’E. coli (DH10Bac™) plutôt que sur la recombinaison homologue dans des cellules d’insectes. Le nouveau vecteur pFastBac™ HBM TOPO™ permet l’expression de protéines sécrétées, car il possède le signal de sécrétion de la mélittine d’abeille (HBM). Le nouveau vecteur doit être fortement considéré pour l’expression des glycoprotéines. Les glycoprotéines ne peuvent pas être glycosylées en l’absence de tout signal de sécrétion. Contrairement aux glycoprotéines sécrétées par les cellules de mammifères, les glycoprotéines sécrétées par le baculovirus peuvent facilement être déglycosylées in vitro. C’est une caractéristique très importante pour cristalliser les protéines !

Le vecteur pFastBac™ HBM TOPO™ possède également une extrémité C-terminale His-Tag avec un signal de clivage TEV pour faciliter la purification des protéines de fusion histidine sur des résines chélatrices au nickel (Système de purification PROBOND™) et des protéines natives à l’aide de la protéase AcTev™.
Le vecteur utilise le promoteur de polyédrine puissant pour générer des niveaux élevés d’expression dans diverses lignées cellulaires d’insectes, telles que les cellules Sf9, Sf9 Mimic™, Sf21 et les cellules High Five™ dans les milieux Sf-900 II & Sf-900™ III de Gibco.

Les systèmes traditionnels de baculovirus nécessitent la purification et l’amplification d’un surnageant viral initial à faible titre. Cela nécessite un dosage sur plaque chronophage. Cependant, les vecteurs pFastBac™ de Bac-to-Bac™ se recombinent avec le bacmide parent dans les cellules compétentes DH10Bac™ E. coli pour former un bacmide d’expression. Transfectez le bacmide dans des cellules d’insectes pour une production rapide d’un titre élevé de particules de baculovirus recombinant pur dans la toute première transfection. Vous économiserez des semaines de temps précieux. Collectez un stock pur de baculovirus P2 le jour 10 sans la nécessité d’un dosage fastidieux des plaques.

Usage exclusivement réservé à la recherche. Ne pas utiliser pour des procédures de diagnostic.

Spécifications

Lignée cellulaireHigh Five™, Sf21, Sf9

Type de celluleCellule d’insectes

ClivageSite de reconnaissance des protéases TEV

Méthode de clonageBlunt TOPO

Mécanisme d’expressionExpression à base de cellules

Système d’expressionBaculovirus

À utiliser avec (application)Expression de protéines

Compatibilité à haut débitCompatible haut débit, non compatible haut débit (manuel)

Principales fonctionsExpression sécrétée

Nbre de réactions20 réactions

Gamme de produitsBac-to-Bac, TOPO

Type de produitKit de clonage

AccélérateurPolyédrine

Marqueur de protéineHBM (mélittine d’abeille), marquage His (6x)

Agent de sélection (eucaryotique)Néant

VecteurpFastBac/HBM-TOPO

FormatKit

Unit SizeEach

Contenu et stockage

Le kit de clonage Bac-to-Bac™ HBM TOPO™ contient : (Pour plus de détails, voir le manuel)
• Kit de vecteur pour 20 réactions de clonage topo
• Vecteur pFastBac⁄HBM TOPO™ contenant le clivage TEV d’extrémité C-terminale et le marquage His.
• Plasmide de contrôle pFastBac⁄CT-Gus (vecteur d’expression de contrôle)
• Autres réactifs fournis : 10x PCR, mélange dNTP, solution saline, eau stérile, modèle PCR de contrôle, amorce sens de polyédrine, amorce antisens SV40 pA
• Kit contenant des cellules compétentes (20 réactions) :
• E. coli chimiquement compétentes One Shot™ Mach1-T1R

Kit de vecteur : conserver à -20°C
E.coli chimiquement compétentes One Shot™ Mach1-T1R : conserver à -80°C

Foire aux questions (FAQ)

I cannot grow this white colony in liquid culture. What should I do?

The concentration of gentamicin might be too high. Try lowering the amount to 5 µg/mL and try adding more of the colony to the culture medium.

What has happened when I see blue colonies? How about colonies which are blue in the center and white on the edges?

In the case of a blue colony, the E. coli has the bacmid and the plasmid in it, allowing the cells to survive the selection process. However, because the transposition has not occurred, the LacZ gene is not disrupted. For bulls-eye colonies, this indicates that the transposition took place when the colony was growing. Re-streaking for an isolated clone from the white portion of the mixed colony should yield some colonies where transposition occurred.

I'm getting mostly white/wild-type plaques instead of blue/recombinant plaques. What am I doing wrong?

This is typically an indication of poor homologous recombination. Check the plasmid/linear DNA ratio you used. If there are some blue plaques, however, expand those viruses and check for their protein. In our experience, they are correct, even if they were in relatively low abundance.

I've infected my cells and see large polyhedra in one cell and smaller polyhedra (more numerous) in a neighboring cell. Is this normal?

Yes, cells are infected with wild-type virus individually and will develop polyhedra at different rates until all the cells in the flask are infected. The polyhedra in cells will form in approximately 3-4 days, differing in size and number until they reach their maximum capacity and burst the cell, releasing tiny particles of virus into the medium.

I'm worried that I am not getting plaques. How many days does it take to see plaques and what size are they typically?

Normally, very small white dots show up about 5-7 days and 1 mm plaques show up around day 10. Plaques can vary in size from 1 mm to 4 mm.

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