5(6)-SFX (6-(Fluorescein-5-(and-6)-Carboxamido) Hexanoic Acid, Succinimidyl Ester), mixed isomers

La fluorescéine est un réactif de dérivatisation vert fluorescent courant, tandis que les esters succinimidyliques sont fréquemment utilisés pour le marquage des amines primaires (R-NH₂) des protéines, des oligonucléotides modifiés par des amines et d’autres molécules contenant des amines. Cet ester succinimidylique “SFX” contient un espacement amino-hexanoyle à sept atomes entre le fluorophore et le groupe réactif. Cet espacement sépare le fluorophore de la biomolécule à laquelle il est conjugué, ce qui peut réduire l’extinction qui se produit généralement lors de la conjugaison. Les conjugués de fluorescéine qui en résultent peuvent être détectés avec des ensembles de filtres FITC ou GFP standard. Les colorants à base de fluorescéine et leurs conjugués présentent un taux relativement élevé de photoblanchiment et une fluorescence sensible au pH. Alexa Fluor™ 488 et Oregon Green™ 488 sont des colorants alternatifs dont les spectres imitent ceux de la fluorescéine et sont beaucoup plus photostables avec peu ou pas de sensibilité au pH dans la gamme de pH physiologique.

Caractéristiques :

• Marquage fluorophore : fluorescéine

• Groupe réactif : ester succinimidylique

• Réactivité : amines primaires sur protéines et ligands, oligonucléotides modifiés par les amines

• Poids moléculaire : 586

• Coefficient d’extinction : 74 000 cm^-1M^-1

• Ex / Em du conjugué : 494 / 520 nm

• Colorants similaires sur le plan spectral : Alexa Fluor™ 488, GFP

Réaction de conjugaison typique

Les réactifs amino-réactifs peuvent être conjugués avec pratiquement n’importe quelle protéine ou peptide ; le protocole fourni est optimisé pour des anticorps IgG. Vous pouvez adapter la taille de la réaction à n’importe quelle quantité de protéine, mais la concentration de la protéine doit être d’au moins 2 mg / ml pour des résultats optimaux. Nous recommandons d’essayer trois degrés différents de marquage, en utilisant trois rapports molaires différents du réactif sensible à la protéine.

L’ester succinimidylique de fluorescéine est typiquement dissout dans du diméthylformamide (DMF) ou du diméthylsulfoxyde (DMSO) anhydre de haute qualité et la réaction effectuée dans un tampon de bicarbonate de sodium de 0,1 à 0,2 M, de pH 8,3 et à température ambiante pendant 1 heure. Parce que le pKa de l’amine terminale est inférieur à celui du groupe amino-epsilon de lysine, vous pouvez atteindre un marquage plus sélectif de l’extrémité de l’amine en utilisant un tampon proche du pH neutre.

Purification des conjugués

Les anticorps marqués sont typiquement séparés du colorant libre à l’aide d’une colonne de filtration sur gel comme la colonne Sephadex™ G-25, la colonne Biogel™ P-30 ou une colonne équivalente. Pour des protéines beaucoup plus grandes ou plus petites, sélectionnez un milieu de filtration sur gel ayant un seuil de poids moléculaire approprié ou purifiez par dialyse.

Autres conditionnements

Les esters succinimidyliques réactifs à l’amine à isomères mélangés de la fluorescéine sont également disponibles en unités de 10 x 1 mg (F6129), en format isomère simple (F6106), et avec un espacement plus hydrophile que l’espacement SFX (F6130), ainsi qu’en de nombreux kits pour le marquage des protéines et des acides nucléiques (esters actifs et kits pour le marquage des protéines et des acides nucléiques, tableau 1.2).