Le système d’expression et de clonage Thermo Scientific aLICator™ LIC est conçu à des fins de clonage indépendant de la ligature rapide et efficace et de régulation étroite de l’expression génétique dans E. coli. Les vecteurs d’expression bactérienne pLATE sont conçus pour des niveaux élevés d’expression des protéines cibles, associés à une expression minimale du bruit de fond (non induite), ce qui favorise l’expression de protéines toxiques pour les cellules E. coli. Pour rationaliser et faciliter le processus de clonage d’inserts dans le vecteur d’expression, le système aLICator utilise la technologie de clonage LIC directionnel, une procédure rapide qui assure une grande efficacité du clonage.

L’expression étroitement régulée et le clonage directionnel rapide et efficace font du système d’expression et de clonage aLICator LIC l’outil idéal pour le clonage et l’expression de gènes courants et toxiques dans E. coli.

Points forts

• Clonage LIC haute efficacité
• Contrôle étroit de l’expression génétique
• Expression à haut rendement
• Polyvalent—expression protéique avec et sans marquage avec option d’élimination du marquage

Applications

• Clonage de produits PCR directionnels
• Expression protéique étroitement régulé
• Expression de gènes toxiques

Principe

Le système de clonage aLICator LIC utilise la technologie de clonage LIC directionnel pour rationaliser et faciliter le clonage dans un vecteur d’expression. Le LIC garantit une efficacité de clonage supérieure à 95 % et élimine le besoin de ligature et les étapes de digestion par enzymes de restriction.

La méthode LIC utilise l’ADN polymérase T4 pour créer des saillies simple brin de 14 à 21 nucléotides spécifiques sur les vecteurs pLATE et les inserts d’ADN. L’ADN polymérase T4 a deux activités enzymatiques : l’activité de la polymérase 5’→3’ et l’activité de l’exonucléase 3’→5’. L’activité de l’exonucléase élimine les nucléotides des extrémités 3’ de l’ADN tandis que l’activité de la polymérase restaure la chaîne à l’aide de dNTP et du brin d’ADN complémentaire comme modèle. Dans le protocole LIC, seul le dGTP est inclus dans la réaction, ce qui entraîne l’équilibre des activités de l’exonucléase 3’→5’et de la polymérase 5’→3’ à la première occurrence de la cytosine dans le brin complémentaire. Après l’hybridation, le vecteur LIC et l’insert sont transformés en cellules E. coli compétentes sans l’utilisation de ligase d’ADN T4. La formation de liaisons covalentes aux jonctions vecteur-insert se produit à l’intérieur de la cellule pour produire un plasmide circulaire.

Caractéristiques

Le système se compose de quatre kits basés sur la série pLATE de vecteurs d’expression bactérienne :

• Kit de clonage et d’expression aLICator™ LIC 1 - vecteur pLATE11, expression protéique non marquée.
• Kit d’expression et de clonage aLICator™ LIC 2 (marquage His d’extrémité N-terminale/EK)—vecteur pLATE51, expression protéique à marquage His d’extrémité N-terminale.
• Kit d’expression et de clonage aLICator™ LIC 3 (marquage His d’extrémité C-terminale)—vecteur pLATE31, expression protéique à marquage His d’extrémité C-terminale.
• Kit d’expression et de clonage aLICator™ LIC 4 (marquage His d’extrémité N-terminale/WQ)—vecteur pLATE 52, expression protéique à marquage His d’extrémité N-terminale, clivage WELQut.
• Ensemble d’expression et de clonage aLICator™ LIC 1 (tout-en-un/EK)—vecteurs pLATE11, pLATE51 et pLATE31, choix de l’expression protéique à marquage His d’extrémité N-terminale ou d’extrémité C-terminale non marquée.
• Ensemble d’expression et de clonage aLICator™ LIC 2 (tout-en-un/WQ)—vecteurs pLATE11, pLATE52 et pLATE31, choix de l’expression protéique à marquage His d’extrémité N-terminale ou d’extrémité C-terminale non marquée, clivage WELQut.

Pour les protéines ayant une préférence connue pour la position de marquage 6xHis d’extrémité N-terminale ou d’extrémité C-terminale, il est recommandé d’utiliser le kit d’extrémité N-terminale ou d’extrémité C-terminale approprié. Lorsque les caractéristiques et la structure protéiques ne sont pas bien connues, il est recommandé d’effectuer un clonage dans les trois vecteurs et de déterminer le vecteur le plus compatible pour d’autres recherches.

Produits connexes
Kit d’expression et de clonage aLICator LIC 4 (marquage His d’extrémité N-terminale/WQ)
Kit d’expression et de clonage aLICator LIC 3 (marquage His d’extrémité C-terminale)
Ensemble d’expression et de clonage aLICator LIC 2 (tout-en-un/WQ)
Kit de clonage et d’expression aLICator LIC 1 (non étiqueté)
Kit d’expression et de clonage aLICator LIC 2 (marquage His d’extrémité N-terminale/EK)