Les dosages cellulaires LanthaScreen™ GFP permettent l’analyse de modifications post-translationnelles pour un nombre de protéines cibles dans un contexte de cellules vivantes. La voie PI3K⁄AKT permet de médier les signaux de croissance cellulaire, de survie cellulaire, de transcription, de translation et d’absorption du glucose. En raison de la complexité de cette cascade de signalisation, particulièrement appliquée à la régulation de la cible de la rapamycine (mTOR) chez les mammifères, les méthodes basées sur les cellules sont essentielles pour l’identification correcte des médiateurs de petites molécules de cette voie. La signification de mTOR comme kinase a été soulignée récemment par l’identification de deux complexes multimériques distincts à l’intérieur de la cellule : mTORC1 (inclut Raptor et est sensible à la rapamycine) et mTORC2 (inclut Rictor et est insensible à l’exposition aiguë à la rapamycine). Il a été démontré que mTORC2 phosphoryle et AKT au résidu Ser473 pour une activation complète de cette kinase favorisant la survie. LanthaScreenTM AKT HEK293E est une lignée cellulaire humaine qui exprime constitutivement les protéines de fusion GFP-AKT. Cette cible kinase a été introduite par transfection lipidique et ces cellules sont une population clonale isolée par la FACS, utilisant la fluorescence GFP comme marqueur de tri et la blasticidine pour maintenir les cellules en cours de sélection. En utilisant cette lignée cellulaire, un immunoessai homogène a été développé avec une lecture FRET (TR-FRET) en temps différé dans lequel la phosphorylation induite par l’insuline de Ser473 sur GFP-AKT est détectée dans les lysats cellulaires à l’aide d’un anticorps spécifique au phosphore marqué au terbium. Cette lignée cellulaire a été validée avec différentsiinhibiteurs⁄de stimulation et affiche des valeurs IC50 ⁄ EC50 correctes. De plus, ce test a été optimisé pour des performances dans des conditions expérimentales variables (y compris la densité de placage cellulaire, le temps de stimulation de l’agoniste, la tolérance au DMSO et le temps de développement du test) et affiche d’excellentes données statistiques (Z’ > 0,6) et un bon rapport signal-bruit de fond.