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Kit de clonage pENTR™ / D-TOPO™, avec E. coli chimiquement compétents One Shot™ TOP10

Les kits de clonage pENTR™ / D-TOPO™ utilisent une stratégie de clonage extrêmement efficace et réalisée en 5 minutes (“ClonageAfficher plus
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K24002020 réactions
Référence K240020
Prix (EUR)
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Les kits de clonage pENTR™ / D-TOPO™ utilisent une stratégie de clonage extrêmement efficace et réalisée en 5 minutes (“Clonage TOPO™”) pour cloner directionnellement un produit PCR à extrémités franches dans un vecteur afin de pénétrer dans le système Gateway™ ou le système MultiSite Gateway™. Les produits PCR à extrémités franches clonent directionnellement à une efficacité supérieure à 90 %, sans nécessiter de ligase, de procédures post-PCR ou d’enzymes de restriction.

Le kit est livré avec tout ce qui est nécessaire pour cloner et sélectionner votre gène amplifié par PCR d’intérêt :

• Prêt pour le système Gateway™—Les gènes clonés font rapidement la navette entre plusieurs systèmes de vecteurs
• Rapide et facile—Passez de la PCR au clone d’entrée Gateway™ en seulement 3 étapes en un temps pratique ∼5 minutes seulement
• Efficace—Obtenez plus de 90 % de clones avec l’insert correct dans la bonne direction
• Éprouvé—Des performances fiables depuis plus d’une décennie

Aperçu des kits de clonage pENTR™ / D-TOPO™

VECTEUR

Vecteur pENTR™ / D-TOPO™ Vecteur de clonage directionnel pour l’entrée dans le système Gateway

MÉTHODE DE CLONAGE

Clonage directionnel TOPO™ Ligature directionnelle ∼5 minutes à base de topoisomérase I de produits de PCR amplifiés avec des polymérases et à extrémités franches à activité corrective au vecteur

CELLULES COMPÉTENTES

Deux options Faites votre choix parmi des kits à haute efficacité ou à cellules compétentes à croissance rapide
Accès simple au système Gateway™
Pour l’accès au système Gateway™, il vous suffit d’amplifier par PCR votre gène d’intérêt et d’ajouter le produit directement au vecteur pENTR™ / D-TOPO™ chargé de la topoisomérase fournie. Incubez 5 minutes et transformez les cellules E. coli compétentes fournies. Les clones d’entrée Gateway™ ainsi obtenus et contenant les sites attL sont prêts pour une recombinaison efficace avec votre choix de vecteurs de destination Gateway™.

Vecteur pENTR™/D-TOPO™ optimisé
Le vecteur pENTR™/D-TOPO™ (Figure 1) comprend des sites de séquençage d’amorces M13 et T7 et des sites de recombinaison attL qui flanquent le site d’insertion du produit PCR. Cela vous permet de vérifier facilement le séquençage des clones et de les recombiner en vecteurs de destination Gateway™ contenant les sites attR de votre choix. Un gène de résistance à la kanamycine et une origine pUC sont utilisés pour la sélection et la propagation en nombre élevé de copies dans E. coli.

Clonage directionnel simplifié
Avec la technologie de clonage Directional TOPO™, il n’est pas nécessaire de purifier la PCR, de préparer des vecteurs ni d’effectuer d’autres étapes de manipulation longues d’ADN. Ajoutez simplement votre réaction de PCR directement au vecteur chargé de topoisomérase fourni, incubez 5 minutes, transformez et obtenez jusqu’à 90 % de clones insérés directionnellement. Une saillie à quatre bases sur les paires de vecteurs avec une séquence à quatre bases conçue dans l’amorce sens utilisée dans votre réaction PCR afin de fournir une directionnalité à la réaction de ligature de la topoisomérase (Figure 2).

La puissance de la technologie de clonage par recombinaison Gateway™
La technologie de clonage par recombinaison Gateway™ permet de contourner les limites du clonage médié par restriction, ce qui vous permet d’accéder à pratiquement tous les systèmes d’expression dans une simple réaction de recombinaison Gateway™ efficace à 99 % et réversible d’à peine une heure. La possibilité de déplacer la même séquence d’ADN entre différents vecteurs sans utiliser d’enzymes de restriction, de ligase, d’étapes de sous-clonage, de sélection de colonies innombrables ou de re-séquençage vous fera gagner du temps, de l’argent et économiser vos efforts.

Technologies de clonage de pointe
En matière de clonage, la technologie de clonage TOPO™ et la technologie de clonage par recombinaison Gateway™ sont un partenaire fiable depuis plus de dix ans pour des milliers de scientifiques. Rapides, simples à utiliser et efficaces, le clonage TOPO™ et la recombinaison Gateway™ permettent un clonage rapide ainsi que le transfert ultérieur de gènes entre un large assortiment de vecteurs d’expression Gateway™.

Options du kit
Le kit de clonage pENTR™/D-TOPO™ peut être acheté avec soit des cellules compétentes TOP10 pour un clonage standard, soit des cellules compétentes Mach1™-T1R pour une croissance rapide.

Usage exclusivement réservé à la recherche. Non utilisé à des fins thérapeutiques ou diagnostiques humaines ou animales.
Usage exclusivement réservé à la recherche. Ne pas utiliser pour des procédures de diagnostic.
Spécifications
Méthode de clonageDirectional TOPO™
Nbre de réactions20 reactions
Gamme de produitsOne Shot
Type de produitKit de clonage TOPO
Quantité20 réactions
VecteurpENTR
Unit SizeEach
Contenu et stockage
Le kit de clonage pENTR™⁄D-TOPO™ contient le vecteur pENTR⁄D-TOPO™, dNTP, solution saline, eau stérile, amorces de séquençage M13 universelles, E. coli chimiquement résistant OneShot™ TOP10, milieu S.O.C. et plasmide de contrôle pUC19. Conserver les E. coli compétentes à -80°C. Conserver tous les autres composants à -20°C.

Foire aux questions (FAQ)

Your Gateway-adapted TOPO vectors are supplied with a control template and control primers. Can I obtain the sequence of the control template?

The sequence of the control template is proprietary.

I am using a Directional TOPO Cloning vector for cloning my PCR product. I have screened a bunch of colonies but they all contain my insert cloned in the reverse direction. How can I solve this problem?

Here are possible causes and suggestions:

- Incorrect PCR primer design: Make sure that the forward PCR primer contains the sequence, CACC, at the 5' end. The 4 nucleotides, CACC, base pair with the overhang sequence, GTGG, in the Directional TOPO vector.
- Reverse PCR primer is complementary to the GTGG overhang at the 5' end: Make sure that the reverse PCR primer does not contain the sequence, CACC, at the 5' end.
- Use a thermostable, proofreading polymerase such as Accuprime Pfx DNA Polymerase (Cat. No. 12344024) to produce blunt-end PCR products.

How large of a PCR product can I recombine with a pDONR vector via BP cloning? Does the same apply for TOPO-adapted Entry vectors?

There is no theoretical limit to insert size for a BP reaction with a pDONR vector. Maximum size tested in-house is 12 kb. TOPO vectors are more sensitive to insert size and 3-5 kb is the upper limit for decent cloning efficiency.

How should I clean up my attB-PCR product?

After generating your attB-PCR product, we recommend purifying it to remove PCR buffer, unincorporated dNTPs, attB primers, and any attB primer-dimers. Primers and primer-dimers can recombine efficiently with the Donor vector in the BP reaction and may increase background after transformation into E. coli, whereas leftover PCR buffer may inhibit the BP reaction. Standard PCR product purification protocols using phenol/chloroform extraction followed by ammonium acetate and ethanol or isopropanol precipitation are not recommended for purification of the attB-PCR product as these protocols generally have exclusion limits of less than 100 bp and do not efficiently remove large primer-dimer products. We recommend a PEG purification protocol (see page 17 of the Gateway Technology with Clonase II manual). If you use the above protocol and your attB-PCR product is still not suitably purified, you may further gel-purify the product. We recommend using the PureLink Quick Gel Extraction kit.

I'm getting low cloning efficiency with my directional TOPO cloning reaction. What should I do?

Here are suggestions to try to increase your cloning efficiency with dTOPO cloning:

- Ensure that the 5' primer has CACC and the 3' primer does not have sequence similarity to GTGG.
- The molar ratio of PCR product: TOPO vector used is critical to success.

We recommend using a 1:1 to 2:1 molar ratio, starting with a 1:1 of PCR product: TOPO vector. The TOPO cloning efficiency decreases significantly if the ratio of PCR product: TOPO vector is <0.1:1 or >5:1. These results are generally obtained if too little PCR product is used (i.e., PCR product is too dilute) or if too much PCR product is used in the TOPO cloning reaction. If the yield of the PCR product has been quantitated, the concentration of the PCR product may need to be adjusted before proceeding to TOPO cloning. For pENTR TOPO vectors, using 1-5 ng of a 1 kb PCR product or 5-10 ng of a 2 kb PCR product in a TOPO cloning reaction generally results in a suitable number of colonies.

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Citations et références (9)

Citations et références
Abstract
A novel type of deubiquitinating enzyme.
Authors:Evans PC, Smith TS, Lai MJ, Williams MG, Burke DF, Heyninck K, Kreike MM, Beyaert R, Blundell TL, Kilshaw PJ,
Journal:J Biol Chem
PubMed ID:12682062
A previous report from this laboratory described two novel proteins that have sequence similarity to A20, a negative regulator of NF-kappaB (Evans, P. C., Taylor, E. R., Coadwell, J., Heyninck, K., Beyaert, R., and Kilshaw, P. J. (2001) Biochem. J. 357, 617-623). One of these molecules, cellular zinc finger anti-NF-kappaB ... More
West Nile virus discriminates between DC-SIGN and DC-SIGNR for cellular attachment and infection.
Authors:Davis CW, Nguyen HY, Hanna SL, Sánchez MD, Doms RW, Pierson TC,
Journal:J Virol
PubMed ID:16415006
'The C-type lectins DC-SIGN and DC-SIGNR bind mannose-rich glycans with high affinity. In vitro, cells expressing these attachment factors efficiently capture, and are infected by, a diverse array of appropriately glycosylated pathogens, including dengue virus. In this study, we investigated whether these lectins could enhance cellular infection by West Nile ... More
Identification of an antiangiogenic FGF2-binding site in the N terminus of the soluble pattern recognition receptor PTX3.
Authors:Camozzi M, Rusnati M, Bugatti A, Bottazzi B, Mantovani A, Bastone A, Inforzato A, Vincenti S, Bracci L, Mastroianni D, Presta M,
Journal:J Biol Chem
PubMed ID:16769728
'Long-pentraxin 3 (PTX3) is a soluble pattern recognition receptor with non-redundant functions in inflammation and innate immunity. PTX3 comprises a pentraxin-like C-terminal domain involved in complement activation via C1q interaction and an N-terminal extension with unknown functions. PTX3 binds fibroblast growth factor-2 (FGF2), inhibiting its pro-angiogenic and pro-restenotic activity. Here, ... More
The plant-specific kinase CDKF;1 is involved in activating phosphorylation of cyclin-dependent kinase-activating kinases in Arabidopsis.
Authors:Shimotohno A, Umeda-Hara C, Bisova K, Uchimiya H, Umeda M,
Journal:Plant Cell
PubMed ID:15486101
Cyclin-dependent kinases (CDKs) play essential roles in coordinate control of cell cycle progression. Activation of CDKs requires interaction with specific cyclin partners and phosphorylation of their T-loops by CDK-activating kinases (CAKs). The Arabidopsis thaliana genome encodes four potential CAKs. CAK2At (CDKD;3) and CAK4At (CDKD;2) are closely related to the vertebrate ... More
Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis.
Authors:Kobae Y, Uemura T, Sato MH, Ohnishi M, Mimura T, Nakagawa T, Maeshima M,
Journal:Plant Cell Physiol
PubMed ID:15653794
Cation diffusion facilitator (CDF) proteins belong to a family of heavy metal efflux transporters that might play an essential role in homeostasis and tolerance to metal ions. We investigated the subcellular localization of Arabidopsis thaliana AtMTP1, a member of the CDF family, and its physiological role in the tolerance to ... More
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