El kit de precipitación magnética de ARN-proteína Thermo Scientific Pierce proporciona a los investigadores un método simplificado y sólido para enriquecer la interacciones proteína-ARN usando ARN marcado en el extremo terminal como cebo.

Características del kit de precipitación magnética de ARN-proteína:

• Directo: captura complejos de ribonucleoproteínas directamente con ARN marcado en el extremo terminal, no utiliza ni necesita ARN para la purificación
• Fácil de utilizar: no es necesario ni tubos de centrífuga ni centrifugación para el enriquecimiento en RBP; procedimiento simplificado con tiempo mínimo de trabajo (menos de 3 horas) tras la reacción de marcado del ARN
• Uso flexible: in vitro ARN transcrito o ARN sintético para el marcado de moléculas de diversas longitudes y complejidades; enriquecimiento de proteínas adecuado usando lisados endógenos, con productos sobreexpresados e in vitro
• Específico: fondo de gránulos bajo; RBP especificadas no significativamente enriquecidas en ARN no relacionado o mutado
• , Económico: más barato que adquirir ARN marcado en el extremo terminal sintético, gránulos magnéticos y reactivos por separado
• Completo: contiene módulos tanto de marcado como de enriquecimiento con los tampones necesarios para el ensayo, ARN control positivo, ARN control negativo y anticuerpo anti RBP incluidos

El kit de precipitación magnética de ARN-proteína proporciona reactivos para el enriquecimiento eficaz en proteínas de unión a ARN (RBP) usando ARN marcado en el extremo terminal con gránulos magnéticos de destiobiotina y estreptavidina. El kit completo contiene reactivos suficientes para 20 reacciones de marcado de ARN y para 20 ensayos de purificación de complejos proteína-ARN. Este enriquecimiento directo de la interacción proteína-ARN proporciona una alternativa a la captura mediante anticuerpos de los complejos proteína-ARN o de restos incorporado al ácido nucleico. Una ventaja añadida al kit es que incluye controles validados tanto para el marcado como para el ensayo de purificación. El kit puede utilizarse en diversas aplicaciones posteriores, como Western blot y espectrometría de masas (EM).

Incluye:
El kit completo contiene el kit Pierce de destiobiotinilización del extremo 3’ del ARN, controles de ARN positivo y negativo, gránulos magnéticos de estreptavidina compatible con ácido nucleico y tampones para enriquecimiento y elución de RBP

Requiere:
ARN y lisado suministrados por el usuario (muestra experimental)

Aplicaciones:
• Análisis mutacional
• Análisis de la función de la estructura
• Identificación de interacciones ARN:proteína
• Análisis por EM de interacciones de parejas o complejos de ARN:proteína desconocidos

El uso de ARN marcado como cebo para el enriquecimiento de proteínas de unión a ARN supone una ventaja con respecto al enriquecimiento con anticuerpos porque la captura se produce mediante interacción directa. En este kit se incluye el kit de destiobiotinilización de extremo 3’ de ARN Pierce , en el que se usa la ARN ligasa de T4 para unir un único nucleótido de bifosfato de citidina a los extremos 3 del ARN de cadena sencilla. La destiobiotina puede usarse para detección o como un soporte de afinidad eluíble. La longitud del espaciador entre el nucleótido y la destiobiotina se ha optimizado para obtener una unión eficaz a los gránulos sin que se vea afectada la accesibilidad del ARN a la proteína.

El procedimiento para el enriquecimiento en proteínas de unión a ARN se ha optimizado para facilitar su uso. En primer lugar, el ARN marcado es capturado por los gránulos para orientar la unión del ARN con las proteínas. A continuación, los gránulos unidos a ARN se equilibran en el tampón de unión de proteínas y ARN antes de que se añada el lisado de proteínas. Tras el lavado, la muestra puede eluirse usando Biotin Elution Buffer o tampón de carga de PAGE-SDS no desnaturalizante. Las muestras eluidas están listas para una gran variedad de aplicaciones posteriores, como la transferencia Western blot o la espectrometría de masas.

El sistema de control para el ensayo de «pull-down» utiliza el ARN del receptor de andrógenos (AR) de la región 3’ no traducida, ARN poli(A)25 y lisado de células de mamíferos. La región 3’ proximal no traducida (UTR) del ARN del receptor de andrógenos contiene regiones ricas en UC para proteínas HuR y de unión a Poli(C) (CP1 y 2). Estas proteínas de unión a ARN regulan la estabilidad del ARNm (HuR) y el recambio y traducción del ARNm (CP1 y 2). El ARN de control negativo, ARN poli(A)25, no contiene sitios de unión de HuR o Poli(C) BP.

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