Oncomine™ Breast cfDNA Research Assay v2

El ensayo Oncomine Breast cfDNA v2 forma parte de una solución completa para detectar ADN derivado de tumores mamarios (ctDNA) en ADN libre de células (cfDNA). Proporciona los reactivos para la construcción de bibliotecas y un solo grupo de cebadores de PCR multiplex para la preparación de bibliotecas de amplicones a partir de cfDNA obtenido de la fracción plasmática de un solo tubo de 10 ml de sangre completa.

Las biopsias líquidas ofrecen varias ventajas sobre las biopsias convencionales de tumores sólidos:
• Menos invasivas, lo que permite tomarlas en varios puntos temporales para controlar la progresión del cáncer
• Menor coste
• Tiempo de obtención de respuesta más rápido desde la muestra a los resultados
• Mejor representación de la heterogeneidad del tumor

El ensayo Oncomine Breast cfDNA v2 permite el análisis de:
• Genes con hotspots: AKT1, EGFR, ERBB2, ERBB3, ESR1, FBXW7, KRAS, PIK3CA, SF3B1, TP53 (∼152 hotspots)
• Genes de número de copias (CNVs): CCND1, ERBB2, FGFR1
• Genes de longitud completa: TP53 (∼80 % de cobertura)

Se ha identificado que estos genes mutan con frecuencia en el cáncer de mama. Mediante el uso de la tecnología de secuenciación de etiquetas, se pueden alcanzar límites bajos de detección (LdD) para diferentes tipos de variantes*:
• Para los SNV/indeles cortos, se puede lograr una LOD del 0,1 % con sensibilidad del ∼80 % y especificidad de >99 %
• Para la detección de mutaciones TP53, se puede alcanzar un LOD del 0,5 %
• Para los objetivos CNV FGFR1 y ERBB2, se puede lograr una detección tan baja como una amplificación de 1,2 veces y para el objetivo CNV CCND1, se puede lograr una detección tan baja como una amplificación de 1,4 veces con una sensibilidad >90 % y una especificidad >99 %

. Todo el flujo de trabajo (figura siguiente), desde el aislamiento de cfDNA mediante el kit de aislamiento de ADN sin células MagMAX (n.º de cat. A29319) para el análisis de muestras, se puede realizar en solo dos días con el sistema de secuenciación Ion S5 XL.

Tecnología
El cfDNA (ctDNA) se encuentra en concentraciones extremadamente bajas en la fracción plasmática de sangre completa. Debido a esta baja prevalencia, en este ensayo se utiliza una tecnología de secuenciación de etiquetas. La tecnología adjunta etiquetas moleculares únicas a los cebadores específicos de genes (figura siguiente). Después de la amplificación, las moléculas etiquetadas se agrupan en función de las etiquetas amplificadas. Los grupos que contengan la misma variante mutante el 80 % del tiempo o más se denominarán positivos. Con la tecnología de etiquetas, se eliminan los grupos que contienen errores aleatorios generados durante el proceso de secuenciación/construcción de bibliotecas.

A diferencia de otras tecnologías con LOD de 1–5 %, el ensayo Oncomine Breast cfDNA v2 tiene un límite de detección flexible de 0,1 % para los SNV o una copia mutante en un fondo de 1000 copias de tipo natural. Para lograr un LdD del 0,1 %, se requieren 20 ng de cfDNA de entrada. Se pueden utilizar cantidades más bajas de cfDNA, pero el % de LOD será mayor en función de la cantidad de entrada (figura siguiente).

Ventajas:
• El diseño optimizado de amplicones para cfDNA corto garantiza la máxima velocidad de captura
• El diseño optimizado de ensayos específicos permite una secuenciación de última generación (NGS) altamente multiplexada, lo que reduce los costes de secuenciación por muestra
• Flujo de trabajo eficiente en solo dos días

El análisis de los SNV y los indeles cortos se puede realizar con Torrent Suite Software 5.2 o superior. Para analizar SNV, indeles cortos y CNV, se requiere Ion Reporter 5.6 (basado en la nube o en servidor).

Simplicidad, velocidad y escalabilidad de la tecnología de secuenciación de etiquetas
El ensayo Oncomine Breast cfDNA v2 permite realizar estudios genéticos de cáncer desde solo 1 ng de cfDNA de entrada para la construcción de bibliotecas dirigidas. El ensayo cfDNA utiliza un equipo de PCR estándar y dos reacciones PCR simples, una para conectar las etiquetas moleculares únicas y la segunda para amplificar la biblioteca, para una selección de objetivos basada en PCR multiplex de alto nivel. Además, el ensayo Oncomine Breast cfDNA v2 es compatible con muestras FFPE para posibles estudios de concordancia. El tiempo total para las bibliotecas objetivo es de solo 3,5 horas. La capacidad de ampliación y la flexibilidad se logran con el conjunto de códigos de barras de secuenciación de etiquetas 1-24 (n.º de cat. A31830) o 25-48 (n.º de cat. A31847) para muestras de códigos de barras de multiplexing en chips Ion S5.

*La sensibilidad y la especificidad de cada tipo de variante se determinaron mediante una recogida de muestras positivas y cfTNA aislado de donantes sanos normales.