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Préparation des échantillons
La préparation des échantillons est essentielle à la réussite des analyses HPLC et UHPLC. Voici quelques exemples de préparation d’échantillons :
- Transformation d’échantillons solides sous forme liquide
- Simplification des mélanges complexes
- Suppression de la matrice interférente
- Concentration ou dilution
Il existe de nombreuses techniques de préparation des échantillons et chaque méthode présente un avantage particulier ou s’utilise dans une application spécifique.
Développement de la méthode HPLC
Ressources connexes
Méthode de préparation | Principe analytique | Application(s) |
Dilution | Diminution de la concentration de l’analyte, du solvant ou de la matrice dans l’échantillon | Prévention de la surcharge de la colonne / du détecteur, réduction de la force d’élution du solvant de l’échantillon |
Centrifugation | Sédimentation basée sur la densité | Élimination des grands composants cellulaires de la solution |
Filtration | Élimination des particules de l’échantillon | Prolongation de la durée de vie de la colonne, prévention du colmatage de la fluidique |
Précipitation de protéines | Désolubilisation des protéines en ajoutant un sel, un solvant ou en modifiant le pH | Élimination des protéines de la solution |
Extraction liquide-liquide | Isolation des composants de l’échantillon sur la base des différences de solubilité dans deux solvants miscibles | Purification des composés sur la base de la polarité / charge |
Extraction en phase solide | Séparation / purification sélective d’analytes cibles à l’aide d’une phase stationnaire absorbante | Isolement de petites molécules à partir de matrices biologiques, dessalage de grandes biomolécules |
Capture d’immunoaffinité | Purification sélective d’un analyte à l’aide d’un anticorps | Isolement de petites molécules à partir de matrices biologiques / environnementales / alimentaires et de boissons |
Digestion des protéines | Clivage enzymatique de protéines en peptides | Génération de peptides pour la protéomique « bottom-up » / cartographie de peptides |
Dérivatisation | Réaction chimique visant à modifier les propriétés physicochimiques de l’analyte | Amélioration de la rétention, de la stabilité ou de la détectabilité de l’analyte |
Exclusion stérique | Séparation des composants des échantillons en fonction de leur taille | Échange de tampons protéiques / dessalage, élimination des macromolécules |
Homogénéisation | Décomposition de la structure d’un échantillon solide à l’aide d’une force mécanique | Perturbation des tissus biologiques et des échantillons environnementaux en vue d’une meilleure extraction |
Processus en plusieurs étapes comprenant l’homogénéisation, l’extraction liquide-liquide, la centrifugation, l’extraction en phase solide | Extraction de pesticides à partir d’échantillons alimentaires et environnementaux |
Effets de matrice
Qu’est-ce que la matrice d’échantillon ?
On peut considérer que la matrice d’échantillon correspond à tout ce qui se trouve dans l’échantillon, à l’exception des analytes d’intérêt, ce qui inclut tout, des sels aux autres composés et aux solvants. Le type de matrice peut dicter la préparation de l’échantillon, le mode de chromatographie et la méthode de détection. La compréhension de la matrice de l’échantillon est un élément fondamental à prendre en considération dans le développement de la méthode.
Que sont les effets de matrice ?
L’effet de matrice est un terme général qui décrit la tendance des matrices d’analytes spécifiques à altérer la détection ou la quantification d’un analyte. Cet effet se manifeste généralement par un biais et se traduit par une sous-estimation ou une surestimation de la concentration de l’analyte existant dans la solution.
Les effets de matrice peuvent apparaître à presque toutes les étapes d’une analyse, y compris la préparation de l’échantillon, la séparation sur la colonne et la détection. Voici quelques exemples généraux :
- Co-élution d’un composé absorbant les UV avec l’analyte d’intérêt
- pH de l’échantillon modifiant le facteur de rétention des analytes ionisables
- Suppression ionique de l’analyte dans l’ionisation par électronébulisation
Comment atténuer les effets de la matrice d’interférence
Il existe quelques moyens couramment utilisés pour atténuer les effets de matrice. Le choix approprié dépend des spécificités de l’analyse.
Si la sensibilité de l’analyte est suffisante, l’approche la plus simple consiste à diluer l’échantillon dans un solvant d’injection approprié. Un échantillon plus dilué donne un effet de matrice plus négligeable.
D’autres solutions incluent une extraction avant l’analyse, qui améliore la séparation en éliminant les sources possibles de contamination de l’échantillon. L’utilisation d’une 2D-LC ou le passage à une méthode de détection plus sélective peut également permettre de contourner les effets de matrice.
Enfin, vous pouvez effectuer un ajout d’étalons sans changer de méthode. Mais cette technique est généralement évitée en raison de l’augmentation du nombre d’injections par échantillon.
Étapes de la méthode
Étapes de développement de la méthode
Dans les cas où il n’existe pas de méthode établie, une planification et une exécution minutieuses sont nécessaires pour mettre au point une procédure fiable. Outre la préparation de l’échantillon, quatre étapes principales doivent être respectées lors de la création d’une méthode HPLC ou UHPLC :
Reconnaissance de la méthode. Il s’agit de sélectionner différentes conditions de colonne et d’éluant. L’objectif de cette phase est de sélectionner les meilleures combinaisons pour une séparation HPLC réussie. Dans la pratique, la reconnaissance de méthodes nécessite un travail manuel important pour le changement de colonne et de phase mobile et la création de méthodes d’instruments. En comprenant les propriétés de l’analyte cible, la recherche peut être initialement limitée à plusieurs colonnes candidates parmi les plus prometteuses.
Optimisation de la méthode. Comprend des essais itératifs de diverses conditions de séparation de la méthode HPLC et est effectuée pour obtenir les meilleures résolution, vitesse et reproductibilité possibles. Cette étape est la partie la plus longue de l’élaboration d’une méthode et nécessite souvent les connaissances d’un expert pour être parfaite.
Tests de fiabilité. Cette opération a pour but de déterminer l’impact de la modification des paramètres de la méthode de séparation. L’optimisation de la fiabilité est importante pour de nombreux processus de développement et de validation de méthodes.
Validation de la méthode. Le processus spécifique à l’industrie permettant de déterminer si une méthode d’analyse développée correspond à l’application souhaitée.
Développement de méthode HPLC étape par étape
La mise au point d’une méthode HPLC ou UHPLC solide, reproductible et fiable peut s’avérer fastidieuse, même pour un expert en chromatographie liquide expérimenté. Cette vidéo vous enseigne toutes les étapes nécessaires pour développer correctement une méthode LC.
Considérations relatives à l’élaboration de la méthode
Pour le développement de la méthode, trois paramètres jouent un rôle : il s’agit, dans l’ordre croissant d’importance, de la rétention du composé (k), de l’efficacité (N) et de la sélectivité (a). Un moyen classique d’ajuster la sélectivité consiste à changer la la composition chimique de la colonne et les éluants. Si cette modification est manuelle, cette tâche prend souvent beaucoup de temps. Heureusement, la technologie moderne permet d’automatiser ces processus.
Ressources pour le développement de méthodes
La mise au point d’une méthode HPLC ou UHPLC solide, reproductible et fiable peut s’avérer fastidieuse, même pour un expert en chromatographie liquide expérimenté.
Dans certains cas, vous pouvez éviter complètement le développement de méthodes en consultant la bibliothèque Thermo Scientific d’applications analytiques AppsLab. Cette bibliothèque en ligne contient un catalogue consultable de milliers d’applications avec des informations détaillées sur les méthodes et des procédures eWorkflow™ pré-remplies.
Les monographies de pharmacopées établies telles que la pharmacopée américaine (USP) et la pharmacopée européenne (Ph. Eur.) constituent d’autres sources pouvant être utiles pour définir les paramètres démarrage de la méthode.
Influence du comportement de rétention, de l’efficacité de la colonne et de la sélectivité sur la résolution chromatographique de deux composés
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Méthodes automatisées
Développement de méthodes automatisées
Le développement d’une méthode LC est toujours très chronophage et fastidieux dans de nombreux laboratoires, mais le développement automatisé de méthodes est un processus qui permet d’économiser beaucoup de temps et de ressources. Différents outils matériels et logiciels sont disponibles pour accélérer le processus de développement des méthodes, améliorer la qualité finale des méthodes et réduire le temps de développement de plusieurs semaines, voire de plusieurs mois, à quelques jours.
Schéma de l’installation d’un système de reconnaissance de méthode
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Matériel pour le développement de méthodes
Les deux principales capacités matérielles requises pour le développement automatisé de méthodes sont les suivantes :
Changement automatique des solvants. Cette technologie permet de changer de phase mobile au cours d’une séquence sans avoir à changer manuellement de bouteille et à purger le système. Les systèmes de développement de méthodes Thermo Scientific Vanquish comprennent un kit d’extension de solvant avec une vanne de sélection externe pour la reconnaissance automatisée d’un maximum de 10 solvants par canal.
Changement automatique de colonne. Utilisée pour les premières étapes du développement d’une méthode et comprend généralement la recherche de plusieurs chimies de phase stationnaire. Le changement automatique de colonne permet d’économiser du temps et de l’énergie en évitant de devoir interrompre les séquences pour changer manuellement les raccords d’une colonne à l’autre. Le kit de reconnaissance de méthodes Thermo Scientific Viper comprend toutes les connexions fluidiques et les capillaires nécessaires à la recherche de chimies à quatre colonnes.
Logiciel de développement de méthodes
Un processus de développement de méthodes entièrement automatisé nécessite un logiciel spécifique pour guider le processus, de l’identification de la méthode à la validation. Plusieurs logiciels comprennent des fonctions allant de la prédiction du comportement de rétention de l’analyte à la génération de séquences.
ChromSwordAuto Chromeleon Connect, par exemple, utilise une approche basée sur l’intelligence artificielle pour l’optimisation des méthodes. ChromSword AutoRobust Chromeleon Connect utilise une approche multiple pour rationaliser la fiabilité des méthodes automatisées et l’évaluation de la stabilité des systèmes. Les deux options sont entièrement intégrées dans Chromeleon pour simplifier l’expérience utilisateur.
Un autre logiciel important, compatible avec les systèmes Thermo Scientific HPLC, est S-Matrix® Fusion QbD® qui s’appuie fortement sur l’approche de la qualité par la conception pour le développement de méthodes.
Foire aux questions
Le développement d’une méthode HPLC nécessite quatre étapes différentes : la reconnaissance de la méthode, l’optimisation de la méthode, les tests de fiabilité et la validation de la méthode.
La validation de la méthode est un processus formel et systématique de mise en œuvre de procédures d’investigation visant à vérifier que la méthode HPLC est appropriée et apte à fournir des résultats satisfaisants et cohérents dans les limites décrites pour cette méthode.
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