流式计数黑科技，实验效率大大提升！

Part 1 细胞计数方法概述

传统手动计数法

使用血球计数板和台盼蓝染色，尽管经典但费时费力，且手动误差大，重复性有限。遇到样本浓度异常，结果稳定性很差。

自动化细胞计数仪

如Countess™自动细胞计数仪，操作简便，解放双手，体积小巧可以放进超净台。

流式细胞计数法

流式细胞仪： 使用注射泵作为动力来源的流式细胞仪，如Attune™ NxT流式细胞仪，能够对样本体积进行精确控制，无需依赖计数微球进行细胞浓度分析。

流式细胞仪+计数微球： 对于无法精确控制样本体积的流式细胞仪，通过引入计数微球，可以实现高效且准确的细胞浓度计算，并结合抗体染色，实现不同细胞亚群的浓度测定。

Part 2 流式细胞计数原理——微球如何成为“标尺”？

计数微球是一种浓度准确的微球悬液，这些微球通常在广泛的激发波长和发射波长范围内都能发出明亮的荧光。在样本中加入一定体积已知浓度的计数微球，混合均匀后上机，流式检测微球与细胞信号，区分细胞亚群与微球（图1）之后，通过公式细胞浓度(cells/µL) = (细胞events数 / 微球events数) × (微球浓度 * 添加的微球体积 / 细胞体积) = (细胞events数 / 微球events数) × (微球总数 / 细胞体积)，计算得到细胞浓度。 

注意：上样样品中额外加入的染色缓冲液及其他缓冲液体积无需包含在计算中，例如50 µL的细胞样本和50 µL的微球加入到300 µL的PBS中上机计数，用于计算的细胞体积为50 µL，而不是上样样品的总体积400 µL。

流式计数微球使用的简单流程：

举个例子：

图1 CD4-FITC-A vs SSC-A

细胞样本体积：50 µL，微球总数：56,500 个（可以通过微球浓度*添加的微球体积计算得出）。通过流式分析之后(图1)可以得到CD4+ 细胞events数为3,792，微球events数为10,990，所以根据公式计算得到CD4+细胞浓度为390 cells/µL。CD4+ 细胞浓度 = (细胞events数 / 微球events数) × (微球总数 / 细胞体积) = (3792/10990) × (56500/50) = 390 cells/µL。

Part 3 流式计数微球的优势

• 多参数分析：一次实验即可完成细胞计数、活性测量和表型分析。
• 低浓度样本处理：对于稀有样本，即使靶细胞数量极少，也能准确计数。
• 高精度：通过公式计算，降低人为误差。
• 多种颗粒计数：适用于细胞、细菌、病毒等不同大小颗粒的计数。

Part 4 流式微球常见问题

Q 流式计数微球这么好，就一点痛点都没有么？

A 每种计数方式都有各自的优点和限制性，对于流式微球计数来说，特点非常鲜明，但也有一些因素会影响计数的准确性，如细胞悬液和微球体积的精确性，无法规避样本处理中的样本损失，流式圈门的准确性等。另外，微球由于材质原因，容易聚团，使用之前一般要充分打散混匀，要严格保证储存温度，微球溶液不能冻住。

Q 一般流式计数要收集到多少个微球？

A 这个问题没有一个绝对的答案，也要看靶细胞的稀有度等其他具体情况。常规来讲，至少要收集到1,000个微球。一般来说，会在这个基础上适当提高收集的微球数量，例如5,000-10,000个。

Q 我的微球没有办法跟细胞同时呈现在同一个分析界面内该怎么办呢？

A 为了能够让靶细胞的荧光强度更适于分析，各个荧光通道的电压都需要进行调节设置，可能会出现靶细胞比较合适的电压对于微球来说可能会过高，从而导致靶细胞和微球无法在同一个分析界面内呈现。但实际上，只要能够准确分析到微球的events数和细胞的events数就可以对细胞浓度进行准确计算，而并不要求微球一定要和靶细胞在同一个分析界面下呈现。

Q 我们有哪些微球产品可以用于流式计数？

	CountBright Plus 绝对计数微球	CountBright 绝对计数微球	CountBright PlusReady Tubes
样品类型	任意类型,包括全血和裂解/未经洗涤的全血	任意类型,包括全血和裂解/未经洗涤的全血	任意类型,包括全血和裂解/未经洗涤的全血
微球大小	4微米	7微米	4微米
激发(nm)	UV至808	UV至635	UV至808
发射(nm)	385至860	385至800	385至860
测量参数	细胞数量	细胞数量	细胞数量
货号	C36995	C36950	C40000

	LIVE/DEAD BacLight细菌活性及计数试剂盒	ViroCheck NanoParticle Reference Kit
样品类型	细菌样品	亚微米样品，如病毒
微球大小	6微米	200/500纳米
激发(nm)	不发荧光	UV至633
发射(nm)	N/A	390至810
测量参数	活/死细菌数量	亚微米颗粒如病毒数量
货号	L34856	V10425

流式细胞术是重要的细胞分析方法学，赛默飞世尔科技的Gibco、Invitrogen和Thermo Scientific产品品牌可提供从流式仪器、抗体试剂到丰富资源的流式整体解决方案。其中Invitrogen eBioscience陪伴着每一代流式科学家和技术人员获得成果、共同成长，这些年来我们一起见证以Anti-FoxP3为代表的流式抗体深受喜爱、更多种类的流式荧光染料欣然上市以及赛默飞科学家们的十年如一日技术陪伴，现在有着更丰富的产品和工具，满足高校研究院、生物技术公司、药企等从早期基础研究到临床转化和生产等不同阶段的需求，加速生命科学行业的进程发展。