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新しいベースコーラーを活用した、Indelを含むシーケンス解析の効率化

Written by | Published: 09.05.2025

ダイレクトシーケンス法とは、大腸菌を用いたクローニングなどのステップを介さず、PCR産物を直接鋳型として塩基配列を決定する方法です。クローニングする方法に比べ、短時間で簡便にシーケンス解析結果を取得できるため、広く利用されています。一方、ヘテロ接合で挿入や欠損（Indel）を含むサンプルをダイレクトシーケンス法で解析した場合、Indel以降が二重波形になり、塩基配列の解読が困難になる課題があります。本ブログでは、この課題を解消するためのアプローチをご紹介いたします。

新しいベースコーラー“SDB”

ジェネティックアナライザでシーケンス反応産物を泳動し、取得された蛍光シグナルの情報は、ベースコーラーと呼ばれるアルゴリズムで解析することで、塩基配列の情報に変換されます。当社が提供するシーケンス解析ソフトウエアの多くは、Applied Biosystems™ KB™ Basecallerを採用していますが、新しいベースコーラーとして、Applied Biosystems™ Smart Deep™ Basecaller（SDB）をご利用いただけるようになりました。SDBは、Applied Biosystems™ Sequencing Analysisソフトウエア v8で使用できます※1。
※1　SDBの使用には有料の年間ライセンスの取得が必要です。

KB Basecallerを用いた解析では、ヘテロ接合性Indelを含む塩基配列を正しく解析できない課題がありましたが、SDBでは、より高精度のベースコールが行えます。Sequencing Analysisソフトウエア v8を用い、ヘテロ接合性Indelのサンプルを、KB BasecallerとSDBで解析した結果を図1に示します。赤矢印で示す箇所から波形が二重になっており、この箇所にIndelが存在することがわかります。エレクトロフェログラムの各ピークの上部には、ピーク情報に基づいて解析（ベースコール）された塩基が表示されます。図1は、同一箇所に2つのピークが検出された場合、混合塩基（AとGはR、CとTはY、など）と表示する設定で解析した結果です。Sequencing Analysisソフトウエアでは、塩基情報はIUPAC/IUBコードにのっとって表示されます。KB Basecallerで解析した結果では、ピークが重なっているにも関わらず、単一塩基表示（A、T、G、またはC）されているエラー箇所が複数見られます（図1　赤枠部）。これに対し、SDBで解析した結果は、ピークが重なっている箇所が混合塩基として正しくベースコールされました。

ヘテロ接合性Indelサンプルのシーケンス解析結果

図1. ヘテロ接合性Indelサンプルのシーケンス解析結果
a) KB Basecaller、b) SDBを用いベースコールを実行。混合塩基としてベースコールされた箇所を、黄色でハイライト表示。　赤矢印：Indelが存在すると推定される箇所。 赤枠：ベースコールエラー箇所。

この結果から、SDBがより精度の高いベースコーラーであることをご理解いただけると思います。

混合塩基表示された塩基配列からのIndelの判定

図1に示すように、ヘテロ接合性Indelサンプルは、Indel以降の波形が二重になるため、塩基配列の解読が困難です。SDBでベースコールされた塩基配列を活用することで、この課題を解決できるのではないかと考えました。
解析方法の概念図を図2に示します。SDBでは、Indel以降の二重波形の領域を、正確に混合塩基としてベースコールできます。この解析方法ではまず、SDBでベースコールされた塩基配列中の混合塩基を、単一塩基に変換します。次に、単一塩基に変換された塩基の情報を、リファレンス配列と比較し、リファレンスと異なる塩基を抽出した配列情報を取得します（図2　抽出配列）。リファレンス配列と抽出配列を比較することで、Indelを判定できます。図2の場合、リファレンス配列には存在するC（赤枠部）が、抽出配列では欠損していることがわかります。

Indel解析方法の概念図

図2. Indel解析方法の概念図

専用ツールを用いたIndel解析の効率化

上述した方法で、実際にヘテロ接合性Indelサンプルを解析できるか検証するために、Applied Biosystems™ 3730xl DNAアナライザで取得されたランデータを解析しました。
まず、Sequencing Analysisソフトウエア v8を使用し、ランデータをSDBで再解析しました。再解析したエレクトロフェログラムの一部を図3に示します。a)はヘテロ接合性Indelサンプル、b)はIndelを含まないコントロールサンプルです。SDBで再解析して得られた塩基配列情報（表1）は、テキストファイル（.seqファイル）として出力しました。

シーケンス解析結果

図3. シーケンス解析結果
a)ヘテロ接合性Indelサンプル、b)コントロールサンプル。
混合塩基としてベースコールされた箇所を、黄色でハイライト表示。

表1. SDBでベースコールされた塩基配列

SDBでベースコールされた塩基配列

図2の「混合塩基から単一塩基への変換」、「リファレンス配列と比較し、異なる塩基を抽出」の工程を効率化するために、Microsoft™ Excel™のマクロを使用してツールを作成しました。
作成したツールに、ヘテロ接合性Indelサンプルの.seqファイルを読み込むと、自動的に、混合塩基が単一塩基に変換されます。次にリファレンスとして使用するファイルを読み込みます。今回は、コントロールサンプルをリファレンスとして用いました。リファレンスファイルを読み込むと、ヘテロ接合性Indelサンプルとリファレンスの塩基配列を比較し、抽出配列が自動的に作成されます。ツールでの解析結果の一部を図4に示します。リファレンスと抽出配列を比較することで、Cの欠損と判定できました。

ツールを用いたIndel解析結果

図4. ツールを用いたIndel解析結果

相補鎖側のシーケンス解析データに対しても同じ解析を実施した結果、Gの欠損と分かり、本解析方法で、Indelを判定できることが確認されました。また、SDBと作成したツールを活用することで、今回のサンプルについては、1サンプルあたり5～10分程度でIndelを判定できました。以上の検証結果から、本方法で、ヘテロ接合性Indelサンプルの塩基配列を解析し、効率的にIndelを判定できることがわかりました。

まとめ

ダイレクトシーケンス法は、簡便に塩基配列を解析できる手法として汎用されていますが、ヘテロ接合性Indelサンプルの解析が困難である課題がありました。そこで今回は、この課題を克服するアプローチとして、新しいベースコーラーであるSDBと、専用のツールを用いた解析方法をご紹介しました。Indelをはじめとする変異解析にお困りの方、本解析方法にご興味をお持ちの方は、ぜひテクニカルサポートjptech@thermofisher.comへお問い合わせください。

キャピラリー電気泳動によるシーケンス解析について、より詳しく知りたい方は、こちらからサンガーシーケンスの基本原則を学べる資料をダウンロードしていただけます。また、変異解析用ソフトウエアのセミナーやハンズオントレーニングもございますので、ぜひご活用ください。
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Microsoft and Excel are trademarks of Microsoft Corporation.

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