pHrodo检测pH的指示剂

专利的pH敏感性Invitrogen pHrodo染料在中性pH值时几乎不发荧光,而在酸性环境下可发出明亮的荧光,这种特性使pHrodo成为许多应用的理想pH指示剂。pHrodo染料有红色和绿色两种可选,使您可以在进行其他细胞检测的同时,也可以进行多重pH测定。pHrodo染料可用于检测细胞质或细胞亚结构内的胞内pH。由于其在中性pH值下几乎不发荧光,而且任何非内化的染料基本也不发荧光,省去了洗涤步骤和染料淬灭的必要。

pHrodo染料可用于如下应用:

  • 使用pHrodo染料特异性检测和观测吞噬内吞作用
  • 使用pHrodo染料测量胞质pH,并用pH标准品进行校准
  • 采用pHrodo偶联物追踪抗体内化过程
  • 采用pHrodo偶联物追踪配体内化过程
  • 结合红色或绿色两种染料进行多参数检测实验
pHrodo-indicators
使用pHrodo指示剂检测细胞内pH值。使用Invitrogen pHrodo Green AM细胞内pH指示剂和Invitrogen pHrodo Red 10,000 MW Dextran标记小鼠J774A.1巨噬细胞。使用Intracellular pH Calibration Buffer Kit将pHi调整至指定数值。

检测细胞质pH

检测吞噬作用

检测配体内化过程

随机胺基活性标记

位点特异性抗体标记

抗体内化筛选工具

延时成像显示pHrodo E. coli BioParticles偶联物在小鼠J774A.1细胞吞噬作用中的内化和酸化过程。

延时成像显示 pHrodo E. coli BioParticles偶联物在小鼠J774A.1细胞吞噬作用中的内化和酸化过程。 使用561 nm激光激发,记录570–699 nm发射光范围内的荧光成像,并同时在另一个 PMT上记录白光DIC图像。采用带有63×(NA 1.4)油镜的Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜在共振检流计扫描器模式下(8000 Hz)采集图像,每30秒采集一次,共采集83.8分钟 (未显示所有图像)。该图像由芝加哥大学的Lucy Deriy和Deborah Nelson提供。

检测细胞质pH

检测吞噬作用

检测配体内化

检测内吞作用

随机胺基活性标记

位点特异性抗体标记

抗体内化筛选工具

pHrodo 染料用于流式细胞分析

pHrodo染料用于流式细胞分析。利用pHrodo标记的细菌使其不仅仅适用于酶标仪和显微镜成像平台,也同样适用于流式细胞仪。在此过程中,流式细胞分析数据表明被 pHrodo标记的大肠杆菌E. coli处理后的粒细胞荧光信号显著增强了。采集全血样本并用肝素处理,分成两个100 µL等份。两个等分小包装样本都用pHrodo标记的E. coli处理并旋旋涡混匀。将其中一份样本置于 37°C 水浴中,另一份样本 (阴性对照) 置于冰上。样本经过红细胞裂解和离心,用 FACSCalibur流式细胞仪 (BD Biosciences) 488 nm氩激光和564-606 nm发射滤光片通道进行分析。(左图) 使用前向与侧向散射对粒细胞进行设门选定。(右图)孵育于37°C中的样本显示胞内 pHrodo染料标记E. coli (红色)的荧光增强,与放置在冰浴中抑制吞噬(蓝色)的阴性对照样本形成鲜明对比。

检测细胞质pH

检测吞噬作用

检测配体内化过程

检测内吞作用

随机胺基活性标记

位点特异性抗体标记

抗体内化筛选工具

剂量依赖反应

使用pHrodo Red Zymosan Bioparticles观察吞噬抑制因子细胞松弛素D对RAW细胞的剂量依赖反应和固定对细胞的影响。RAW巨噬细胞接种在完全培养基上并过夜培养。第二天,使用 1X活细胞成像溶液洗涤细胞,然后加入20 μL包含吞噬抑制因子细胞松弛素D的活细胞成像溶液替代原有完全培养基在 37°C 下孵育15分钟,其中细胞松弛素D的浓度分为8个剂量反应点,浓度范围为10 μM 至 3 pM,每个浓度做三个重复。Bioparticles被重悬于2X工作浓度的活细胞成像溶液中,含浓度为2 mg/mL(E. coli和staph)或1 mg/mL(Zymosan)。将重悬液加入细胞,然后将培养板重新放回37°C孵育90分钟,使吞噬过程完全。使用FlexStation酶标仪在 490 Ex/525 Em下进行读板测定,pHrodo Green particles粒采用515 cutoff,pHrodo Red particles采用590 cutoff。通过加入等体积的8% PFA进行固定,多聚甲醛终浓度为4%。

检测细胞质pH

检测吞噬作用

检测配体内化过程

随机胺基活性标记

位点特异性抗体标记

抗体内化筛选工具

延时成像显示pHrodo E. coli BioParticles偶联物在小鼠J774A.1细胞吞噬作用中的内化和酸化过程。

延时成像显示 pHrodo E. coli BioParticles偶联物在小鼠J774A.1细胞吞噬作用中的内化和酸化过程。 使用561 nm激光激发,记录570–699 nm发射光范围内的荧光成像,并同时在另一个 PMT上记录白光DIC图像。采用带有63×(NA 1.4)油镜的Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜在共振检流计扫描器模式下(8000 Hz)采集图像,每30秒采集一次,共采集83.8分钟 (未显示所有图像)。该图像由芝加哥大学的Lucy Deriy和Deborah Nelson提供。

检测细胞质pH

检测吞噬作用

检测配体内化

检测内吞作用

随机胺基活性标记

位点特异性抗体标记

抗体内化筛选工具

pHrodo 染料用于流式细胞分析

pHrodo染料用于流式细胞分析。利用pHrodo标记的细菌使其不仅仅适用于酶标仪和显微镜成像平台,也同样适用于流式细胞仪。在此过程中,流式细胞分析数据表明被 pHrodo标记的大肠杆菌E. coli处理后的粒细胞荧光信号显著增强了。采集全血样本并用肝素处理,分成两个100 µL等份。两个等分小包装样本都用pHrodo标记的E. coli处理并旋旋涡混匀。将其中一份样本置于 37°C 水浴中,另一份样本 (阴性对照) 置于冰上。样本经过红细胞裂解和离心,用 FACSCalibur流式细胞仪 (BD Biosciences) 488 nm氩激光和564-606 nm发射滤光片通道进行分析。(左图) 使用前向与侧向散射对粒细胞进行设门选定。(右图)孵育于37°C中的样本显示胞内 pHrodo染料标记E. coli (红色)的荧光增强,与放置在冰浴中抑制吞噬(蓝色)的阴性对照样本形成鲜明对比。

检测细胞质pH

检测吞噬作用

检测配体内化过程

检测内吞作用

随机胺基活性标记

位点特异性抗体标记

抗体内化筛选工具

剂量依赖反应

使用pHrodo Red Zymosan Bioparticles观察吞噬抑制因子细胞松弛素D对RAW细胞的剂量依赖反应和固定对细胞的影响。RAW巨噬细胞接种在完全培养基上并过夜培养。第二天,使用 1X活细胞成像溶液洗涤细胞,然后加入20 μL包含吞噬抑制因子细胞松弛素D的活细胞成像溶液替代原有完全培养基在 37°C 下孵育15分钟,其中细胞松弛素D的浓度分为8个剂量反应点,浓度范围为10 μM 至 3 pM,每个浓度做三个重复。Bioparticles被重悬于2X工作浓度的活细胞成像溶液中,含浓度为2 mg/mL(E. coli和staph)或1 mg/mL(Zymosan)。将重悬液加入细胞,然后将培养板重新放回37°C孵育90分钟,使吞噬过程完全。使用FlexStation酶标仪在 490 Ex/525 Em下进行读板测定,pHrodo Green particles粒采用515 cutoff,pHrodo Red particles采用590 cutoff。通过加入等体积的8% PFA进行固定,多聚甲醛终浓度为4%。

pHrodo指示剂是什么?

pHrodo染料是一种新型荧光染料,当其周围环境pH值降低时,它会显著增强荧光亮度。pHrodo Green染料及其偶联物最佳吸收波长和最大发射波长分别约为509 nm和533 nm,pHrodo Red染料则分别为560 nm和585 nm。pHrodo Green染料与pHrodo Red染料均可由488 nm氩离子激光器激发,大部分的流式细胞仪、显微镜、和酶标仪仪器均配有这一光源。

pHrodo Red(左图)与 pHrodo Green(右图)染料荧光发射光谱。

pHrodo Red(左图)与pHrodo Green(右图)染料荧光发射光谱。pHrodo染料标记的E. coli 的荧光发射光谱在一系列的50 mM磷酸盐缓冲液中测定,缓冲液pH值由4至10。E. coli浓度为0.1 mg/mL,使用 Hitachi F4500荧光计在532 nm 激发波长下读值。

资源

手册

科学海报

 

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