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フローサイトメトリーを使って RNA とタンパク質を同時に検出

フローサイトメトリーは、数百万の単細胞を同時に獲得および解析すること、マルチプレックス機能を使用すること、および細胞表面と細胞内タンパク質の両方を分かりやすいワークフローで検出することが可能なため、長らく異種起源の細胞集団を同定する標準的手法となっています。それでも、対象の分析物すべてを測定するための抗体の利用可能性や妥当性により、フローサイトメトリーは限定されています。MicroRNA と長鎖ノンコーディング RNA、メッセンジャー RNA、ウイルス転写物、独自のモデル生物、そして抗体の発生が困難な標的は、フローサイトメトリーの力を利用できておらず、また歴史的に研究者はこれらの細胞系を分析するために、分断した多くの実験をする必要がありました。

Invitrogen™ PrimeFlow™ RNA アッセイを使うと、研究者は今や、RNA やタンパク質発現のダイナミクスを百万の単細胞内で同時に明らかにすることができるようになりました。このまったく新しいアッセイは、分岐 DNA (bDNA) 増幅技術とともに蛍光 in situハイブリダイゼーション (FISH) を採用し、蛍光染色と結合した抗体を使って、細胞表面および細胞内タンパク質の免疫表現型検査と組み合わせ、最大 4 つの RNA 標的を同時に検出できます。データは標準のフローサイトメーターを使って収集されます。

PrimeFlow RNA アッセイのワークフロー

 

技術の概要

PrimeFlow RNA アッセイでは、標的 RNA 自体でなく RNA 転写物の検出を増幅するのに、分岐 DNA 技術が使われています。PrimeFlow RNA アッセイは mRNA、長鎖ノンコーディング RNA、microRNA、またウイルス RNA とテロメア DNA を検出できます。microRNA の検出は Invitrogen™ PrimeFlow™ microRNA 前処理バッファー (Cat.No. 88-18006) とプロトコルを使うと最適です。このアッセイの第 1 ハイブリダイゼーション段階では、遺伝子特異的オリゴヌクレオチド Target Probe セット、20 ~ 40 プローブペア (または miRNA プローブセットの場合はシングルペア) が標的 RNA シーケンスに結合します。各プローブペアはシグナル増幅が起こるよう互いに隣接して結合します。その後、連続する一連のハイブリダイゼーション段階を経てシグナル増幅が完了します。PreAmplifier 分子は、それぞれのプローブペアのプローブ両方が標的シーケンスに結合した時だけ、標的プローブとハイブリダイズするため、さらなる特異性をもたらします。その後、複数の Amplifier 分子がそれぞれの PreAmplifier とハイブリダイズします。

最後に、蛍光色素に結合した Label Probe オリゴヌクレオチドが、対応する Amplifier 分子とハイブリダイズします。完全に構築されたシグナル増幅「ツリー」には、400 の Label Probe 結合部位があります。Target Probe セットのすべての標的特異的オリゴヌクレオチドのプローブが、標的 RNA 転写物に結合すると、8,000~16,000 倍の増幅が達成されます。

弊社は現在、マルチカラーフローサイトメトリー解析で異なる RNA 標的を最大 4 種類同時に測定できる、4 種類の独自の増幅構造を提供しています。4 種類のプローブセットは現在入手可能で、Alexa Fluor 647 (タイプ 1 プローブセット)、Alexa Fluor 488 (タイプ 4 プローブセット)、Alexa Fluor 568 (タイプ 10 プローブセット) で標識された RNA を検出できます。一つのサンプルで RNA 標的を複数検出する際、各 Probe Set は、そのシグナルを他と区別するため、固有のタイプである必要があります。PrimeFlow RNA アッセイにより細胞が処理されたら、データはいずれの標準フローサイトメーターでも収集および解析可能です。上の模式図は二つの固有の標的の検出を示しています。

アッセイキットとサポート製品

この PrimeFlow RNA アッセイには、アッセイの実施に必要なすべての試薬が含まれています。対象となる遺伝子用の陽性コントロールプローブと標識プローブは別売です。

主な文献

リソース

Web セミナー
Elia Tait Wojno, Assistant Professor, Cornell University College of Veterinary Medicine
Detection of RNA with Flow Cytometry by Dr. Porichis

サポート