Sanger Sequencing_SARS-CoV-2_research

Gerar resultados direcionados altamente específicos

Com precisão superior a 99% e capacidades de leitura longa, o sequenciamento Sanger é a tecnologia de sequenciamento padrão ouro. E para permitir ainda mais sua pesquisa, a análise de fragmentos por eletroforese capilar (CE) fornece informações de dimensionamento de DNA, quantificação relativa e genotipagem. Com fluxos de trabalho simples, o sequenciamento Sanger e a análise de fragmentos podem ser concluídos em menos de um dia de trabalho, da amostra à resposta, ajudando a tornar sua pesquisa de SARS-COV-2 (o coronavírus que causa a COVID-19) rápida e econômica.

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NOVOS protocolos de sequenciamento para detecção de variantes de SARS-COV-2

Protocolo para encontrar e usar primers de sequenciamento Sanger para qualquer local no genoma do SARS-COV-2, incluindo novas variantes preocupantes 
Faça download do protocolo | Visualize o genoma do SARS-COV-2 e faça pedidos de primers | Busque o genoma do SARS-COV-2 e faça pedidos de primers
Análise de variantes usando o Variant Reporter | Arquivos para o Variant Reporter (zip)
Análise de variantes usando SeqScape | arquivos para o SeqScape (zip)

Protocolo para confirmar rapidamente as alterações do gene S, observadas com o ensaio TaqPath COVID-19, identificando se a deleção 69/70 do gene S está presente 
Faça download do protocolo | Faça pedido de primers

Protocolo flexível para confirmar a presença das linhagens de alta transmissibilidade de SARS-COV-2 B.1.1.7, B.1.351, B.1.1.28, B.1.427 ou B.1.429 em sua amostra.  Escolha os pares de primers que melhor atendam às suas necessidades.
Faça download do protocolo | Faça download de sequências de primers para B.1.1.7 | Faça download de sequências de primers para B.1.351 | Faça download de sequências de primers para B.1.1.28 | Faça download de sequências de primers para B.1.427 | Faça download de sequências de primers para B.1.429

Protocolo para identificar novas variantes no gene Spike por sequenciamento de todo o gene S para o desenvolvimento de vacinas e pesquisa epidemiológica.
Faça download do protocolo | Faça download de sequências de primer

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Por que usar o sequenciamento Sanger em sua pesquisa do SARS-CoV-2?

O sequenciamento Sanger pode complementar as técnicas do seu laboratório e levar a estudos mais eficientes.
  • Desde que foi desenvolvido em 1977, o sequenciamento Sanger tem sido o método de sequenciamento de DNA mais usado nos últimos 40 anos e permanece em uso disseminado em todo o mundo
  • O método Sanger permanece em amplo uso para projetos de menor escala e para confirmação dos resultados NGS
  • Consultas menores com objetivos mais específicos podem se beneficiar de procedimentos laboratoriais mais focados e menos caros
Os benefícios do sequenciamento Sanger

O sequenciamento Sanger é o padrão ouro para sequenciamento de genes únicos, confirmando variantes de genes, detectando sequências repetidas, variação no número de cópias e alterações de nucleotídeos únicos. O sequenciamento Sanger é perfeito para:

  • Sequenciamento de genes únicos e variantes de nucleotídeo único
  • Sequenciamento direcionado de 100 amplicons ou menos
  • Sequenciamento de até 96 amostras por vez, sem código de barras
  • Confirmação de NGS
  • Sequências ricas em GC alto
  • Identificação microbiana
  • Análise de microssatélite (SSR) ou STR
  • Sequenciamento de plasmídeo

Saiba mais:
Sequenciamento Sanger ou NGS?

Embora as tecnologias NGS sejam comuns em laboratórios de pesquisa devido aos recursos de maior rendimento, o sequenciamento Sanger oferece uma solução econômica para suas necessidades de pesquisa.  Não requer equipamentos caros e pode gerar dados de alta qualidade, mesmo para amostras de baixa titulação viral que não produzem alta cobertura do genoma para algumas tecnologias NGS.

Como o sequenciamento Sanger e a análise de fragmentos podem ser usados em sua pesquisa de SARS-COV-2?

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Conforme você trabalha para entender o SARS-CoV-2 para identificar rapidamente futuras opções de tratamento e desenvolver possíveis alvos de vacinas, nosso abrangente portfólio de soluções de pesquisa de sequenciamento Sanger e de análise de fragmentos está aqui para ajudar a avançar em sua pesquisa.

No contexto de um surto, em que um grande número de amostras precisa ser processado com rapidez e precisão, o sequenciamento Sanger e a análise de fragmentos podem ajudá-lo significativamente a obter respostas rapidamente.

Identificação de vírus

No início do surto de SARS-CoV-2, o sequenciamento Sanger foi usado por vários laboratórios para confirmar o patógeno causador como sendo SARS-CoV-2 1-4. Além disso, analisando esses genomas e comparando-os com outros coronavírus conhecidos, foi determinado que o vírus se originou em um reservatório animal que evoluiu de morcegos, com um provável hospedeiro animal intermediário 5,6.

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O sequenciamento Sanger, robusto e econômico, e a análise de fragmentos permitem:
  • Identificar e diferenciar rapidamente o SARS-CoV-2 de outros vírus respiratórios 1-3
  • Confirmar a variante de exclusão do gene 69/70 do SARS-CoV-2 S (Faça download do protocolo)
  • Confirmar as linhagens de cepas de SARS-COV-2 B.1.1.7 e B.1.351 (Faça download do protocolo)
  • Sequenciar rapidamente todo o gene spike (S) do SARS-CoV-2 (Faça download do protocolo)
  • Gere preencher lacunas e sequência de montagem para auxiliar no sequenciamento NGS completo do vírus do genoma1-6
  • Confirmar as variações de sequência identificadas, a partir dos dados NGS completos do genoma 7
  • Utilizar uma abordagem de nested PCR com o sequenciamento completo do genoma para amostras com menos carga viral 8

O sequenciamento Sanger e a análise de fragmentos podem fazer?

Confirmação do resultado de RT-PCR/qPCRTestes rápidos para vários alvos
O sequenciamento Sanger está sendo usado para confirmar os resultados de RT-PCR/qPCR e fornecer confiança para distinguir o SARS-COV-2 de outros patógenos respiratórios. Em um fluxo de trabalho simplificado, o produto do PCR é purificado e os primers de sequenciamento ligam-se às sequências conhecidas na região alvo, permitindo assim que o sequenciamento seja estendido usando eletroforese capilar (CE) 1,3.As soluções de qPCR multiplexadas testam para pequenos números de patógenos, e sua capacidade relativamente pequena pode limitar a produtividade quando um grande número de alvos ou patógenos precisam ser detectados. A análise de fragmentos por CE pode ser usada para testar vários patógenos associados a diferentes síndromes em uma única amostra 9. Por exemplo, um painel respiratório multiplex pode detectar patógenos virais e bacterianos para ajudar a descartar patógenos comuns como causa da infecção.

Saiba mais sobre um método simples para detectar sequências virais de SARS-CoV-2 por meio de soluções de multiplexação de alvos, baseadas em análise de fragmentos:

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Pesquisa de vigilância epidemiológica

De baixo custo, o sequenciamento de Sanger é considerado o método de sequenciamento padrão ouro para confirmar a sequência de genes específicos, incluindo aqueles já sequenciados por NGS. Pode ser usado para:

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  • Sequenciar e confirmar variantes de diferentes genes do SARS-CoV-2 dentro de grupos de amostras sintomáticas e assintomáticas 10-12 e caracterizar os padrões de transmissão e a evolução genética desse vírus entre as diferentes populações 13, 4 
  • Confirmar a origem e a transmissão entre espécies de diferentes coronavírus, o que é importante para entender às possíveis fontes de transmissão zoonótica 15-17
  • Realizar o sequenciamento completo do genoma do vírus para amostras únicas, em locais sem acesso ao sequenciamento de NGS ou para amostras de vírus de baixa titulação 8,11

Um entendimento do tipo e do subtipo de vírus é essencial para uma resposta eficaz à crise. A vigilância também desempenha um papel na compreensão da transmissão entre espécies do vírus e sua propagação espacial ao longo do tempo evolutivo e nas interfaces entre a vida selvagem e a humana.  O monitoramento ajuda a detectar a presença de diferentes variantes do vírus obtidas de amostras com diferentes graus de sintomas, incluindo amostras assintomáticas.

Um possível sistema de aviso antecipado para SARS-COV-2

A identificação do SARS-COV-2 em águas residuais pode fornecer informações quase em tempo real sobre a propagação do vírus e pode ser uma abordagem importante para o monitoramento da propagação do vírus 18,19. Esse método, conhecido como epidemiologia baseada em águas residuais (WBE), pode conseguir agir como um sistema de alerta precoce para surtos de doenças infecciosas em geral e, no futuro imediato, pode ajudar a prever a segunda onda de infecções por SARS-COV-2.  Vários pesquisadores em todo o mundo usaram o sequenciamento Sanger para confirmar a identificação do SARS-CoV-2 em águas residuais, após a identificação viral por RT-PCR ou qPCR 20-22.

Leia mais: SARS-COV-2 em águas residuais: Um possível método de alerta precoce

Um papel para o microbioma faríngeo na compreensão da variabilidade da suscetibilidade à infecção por SARS-CoV-2

Pesquisas indicam que a microbiota faríngea (PM) pode influenciar a suscetibilidade a diferentes infecções virais respiratórias 23,24 , tornando possível que seja importante compreender a epidemiologia do SARS-CoV-2.  A análise de fragmentos por CE pode ser usada para identificar assinaturas microbianas associadas a diferentes fenótipos da doença 25. Baseia-se na ampliação de regiões interespaciais (IS) de rRNA 16S-23S em bactérias para produzir fragmentos de PCR que variam em comprimento e frequência, dependendo das espécies bacterianas. Cada fragmento de PCR pode ser separado e detectado em um analisador genético. Os padrões de fragmentos resultantes são comparados a um banco de dados curado para determinar as espécies presentes na amostra 25.

Leia mais: As diferenças na microbiota poderiam explicar a variabilidade na suscetibilidade ao SARS-CoV-2?

Pesquisa de vacinas e tratamentos terapêuticos:

Há uma necessidade urgente de desenvolver tratamentos antivirais e/ou vacinas seguros e específicos para o SARS-CoV-2. As vacinas fornecem uma solução de longo prazo para reduzir o risco de infecção ao treinar o sistema imunológico para responder de forma rápida e eficaz. Portanto, é fundamental selecionar uma abordagem vacinal e começar com uma pesquisa laboratorial básica para identificar os candidatos a patógenos e antígenos que poderiam causar uma resposta imune.

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Sequenciamento Sanger: a abordagem ideal

Simples, rápido e econômico, o fluxo de trabalho de sequenciamento Sanger é ideal em diferentes etapas do fluxo de trabalho de desenvolvimento de vacinas:

  • Na descoberta do alvo, ele está sendo usado para identificar o vírus e suas variantes
  • Ele pode ajudar na otimização da sequência da vacina de mRNA para maximizar a expressão proteica 26
  • Ele pode ser usado para sequenciar e caracterizar os anticorpos neutralizantes gerados como uma resposta ao vírus, que poderia possivelmente ter utilidade terapêutica ou profilática 27-29

A importância da autenticidade da linhagem celular humana

A pesquisa de vacinas é geralmente realizada com células humanas cultivadas, obtidas de repositórios principais ou de outros pesquisadores. Estima-se que em 15% a 20% do tempo, as células usadas em experimentos foram identificadas incorretamente ou contaminadas de forma cruzada com outra linhagem celular. Embora os principais repositórios agora autentiquem a identidade da linhagem celular, muitos estão solicitando que todos os pesquisadores testem e autentiquem a identidade da linhagem celular usando técnicas padrão de genotipagem, como Genotipagem de STR (Short Tandem Repeat, Repetição em tamdem curto) com CE.

Oferecemos produtos para autenticar a identidade da linhagem celular:

  • Os kits CLA Identfiler Plus e Direct da Applied Biosystems são otimizados para analisar 16 STRs humanos altamente variantes com tempo de ampliação inferior a três horas
  • Também da Applied Biosystems, o software GeneMapper 6 e as soluções de software MSA (análise de microssatélites) baseadas em nuvem facilitam a análise de STRs, fazendo uso de escadas alélicas pré-estabelecidas e conjuntos de compartimentos de dimensionamento para os vários alelos STR cobertos pelos kits identificadores

O papel da eletroforese capilar (CE) no desenvolvimento de medicamentos

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Os vírus emergentes representam um grande desafio para os sistemas globais de economia e de saúde. Devido ao seu potencial pandêmico, como testemunhado no caso do vírus SARS-COV-2, o rápido desenvolvimento e triagem de medicamentos são necessários para combater e conter a propagação da infecção. 

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Como outros cientistas estão usando o sequenciamento Sanger em suas pesquisas de doenças infecciosas?

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"O sequenciamento Sanger pode realizar o que algumas outras novas plataformas não podem, especialmente quando você deseja observar haplótipos de frequência de alelos menos importantes de genes virais contagiosos, que podem não ser capturados em algumas das plataformas de maior rendimento."     

Dra. Lillian Seu
Centro de controle de doenças infecciosas, Zâmbia

Leia como o sequenciamento Sanger foi usado para ajudar a detectar mutações de resistência a medicamentos na pesquisa sobre HIV na Zâmbia

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"A alta precisão e sensibilidade do sequenciamento Sanger o tornam insubstituível na confirmação de mutações pontuais, na determinação da posição do DNA clonado, no sequenciamento de lacunas internas curtas ou na ausência de dados no terminal do genoma." 

Dra. Iryna Goraichuk
Unidade viral aviária exótica e emergente do USDA-ARS

Leia como novos vírus aviários foram descobertos com a ajuda do sequenciamento Sanger

Obtenha resultados de pesquisa do SARS-COV-2 mais rapidamente com um analisador genético de várias aplicações em cartucho único

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  • Execute as amostras de sequenciamento Sanger e de análise de fragmentos na mesma placa e ao mesmo tempo
  • Reduza o tempo de configuração
  • Maximize o espaço em bancada
  • Acesse, analise e compartilhe dados em qualquer lugar, a qualquer momento, com o Connect

Saiba mais ›

Fluxo de trabalho do sequenciamento Sanger

Simples e rápido, o fluxo de trabalho de sequenciamento Sanger pode ser concluído em menos de um dia de trabalho, da amostra à resposta. Oferecemos produtos que suportam muitas etapas de nosso fluxo de trabalho recomendado, desde a ampliação por PCR até a análise de dados.

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Informações para pedidos

Fluxo de trabalho de análise de fragmentos

Desde a preparação direta das amostras até a análise de pico, oferecemos uma ampla gama de produtos e serviços para simplificar cada etapa do fluxo de trabalho de análise de fragmentos.

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Informações para pedidos
Referências

Protocolos de sequenciamento Sanger e análise de fragmentos são mencionados nas publicações abaixo:

  1. Chan, JFW., et. al. (2020) A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 novel coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster. Lancet; 395: 514-23(https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30154-9)
  2. Zhu, N., et. al. (2020) A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med 382;8 (https://doi.org/10.1056/nejmoa2001017)
  3. Caly, L., et. al. (2020) Isolation and rapid sharing of the 2019 novel coronavirus (SARS‐CoV‐2) from the first patient diagnosed with COVID‐19 in Australia. Med J Aust 2020; 212 (10): 459-462. (https://doi.org/10.5694/mja2.50569)
  4. Lam, LT., et. al. (2020) “Whole-genome sequencing and de novo assembly of a 2019 novel Coronavirus (sars-cov-2) strain isolated in Vietnam. Preprint at bioRxiv doi: (https://doi.org/10.1101/2020.06.12.149377)
  5. Zhou, P., et. al. (2020) A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature (579) (https://doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7)
  6. Lu R,. et.al. (2020) Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet: 395: 565-574 (https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30251-8)
  7. Artesi, M., et al. (2020) A recurrent mutation at position 26,340 of SARS-CoV-2 is associated with failure of 2 the E-gene qRT-PCR utilized in a commercial dual-target diagnostic assay. J. Clin. Microbiol. doi:10.1128/JCM.01598-20 (https://doi.org/10.1128/jcm.01598-20)
  8. Paden CR, et al., (2020). Rapid, sensitive, full-genome sequencing of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 26 (10) 3201. (https://doi.org/10.3201/eid2610.201800)
  9. Gomez, J., et al. (2020) “Capillary electrophoresis of PCR fragments with 5´-labelled primers for testing the SARS-Cov-2”. J. Virology 284 113937 (https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2020.113937)
  10. Yuan, Y,. et al. (2020) “Molecular Epidemiology of SARS-CoV-2 Clusters Caused by Asymptomatic Cases in Anhui Province, China” Research Square preprint (https://dx.doi.org/10.21203/rs.3.rs-29833/v1)
  11. Holland, LA., et al. (2020) “An 81 nucleotide deletion in SARS-1 CoV-2 ORF7a identified from sentinel surveillance in Arizona (Jan-Mar 2020)” J. Virology (https://doi.org/10.1128/jvi.00711-20)
  12. Liu, Z., et al. (2020) “Identification of common deletions in 1 the spike protein of SARS-CoV-2”. J. Virology (https:// doi:10.1128/JVI.00790-20)
  13. Zhang, Z-B., et al. (2020) “Genomic surveillance of a resurgence of COVID-19 in Guangzhou, China”. Research Square preprint (https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-35869/v1)
  14. Wang, Y., et al. (2020) “Intra-host Variation and 1 Evolutionary Dynamics of SARS-CoV-2 Population in COVID-19 Patients”. Preprint at bioRxiv doi: (https://doi.org/10.1101/2020.05.20.103549)
  15. Valitutto, M.T., et al. (2020) “Detection of novel coronaviruses in bats in Myanmar,” PLoS One 15(4): e0230802.(https://doi.org/10.1371/journal.pone.0230802)
  16. Latinne A., et al. (2020) Origin and cross-species transmission of bat coronaviruses in China. (Pré-impressão bioRxiv doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.31.116061)
  17. Huong, N.Q., et al (2020) “Coronavirus testing indicates transmission risk increases along 2 wildlife supply chains for human consumption in Viet Nam, 2013-2014 (bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.05.098590.)
  18. Kitajima, M. et al. (2020) “SARS-CoV-2 in wastewater: State of the knowledge and research needs”. Science of the Total Environment 739,  139076. (https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.139076)
  19. Carducci Aet al., (2020) Making Waves: Coronavirus detection, presence and persistence in the water environment: State of the art and knowledge needs for public health. Water Res. 2020;179:115907. (https://doi.org/10.1016/j.watres.2020.115907)
  20. Ahmed W et al. (2020) “First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for wastewater surveillance of COVID-19 in the community”. Sci Total Environ DOI:(https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.138764)
  21. Wu, F.Q. et al. (2020) “SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases.” medRxiv preprint,doi: (https://doi.org/10.1101/2020.04.05.20051540)
  22. Nemudryi, A. et al, (2020) “Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater”, Preprint at medRxiv (https://doi.org/10.1101/2020.04.15.20066746)
  23. De Steenhuijsen Piters WAA, et al. (2016) “Nasopharyngeal microbiota, host transcriptome, and disease severity in children with respiratory syncytial virus infection”. Am J Respir Crit Care Med; 194: 1104–15. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5114450/)
  24. Tsang TK, et al. (2019) “Association Between the Respiratory Microbiome and Susceptibility to Influenza Virus Infection.” Clin Infect Dis; 48109: 1–9. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31562814/)
  25. Budding A., et al., (2020)  “An Age Dependent Pharyngeal Microbiota Signature Associated with SARS-CoV-2 Infection (4/21/2020).” Pré-impressão em (http://dx.doi.org/10.2139/ssrn.3582780)
  26. Zeng, C., et al. (2020) “Leveraging mRNAs sequences to express SARS-CoV-2 antigens in vivo” Preprint at bioRxiv doi: (https://doi.org/10.1101/2020.04.01.019877).
  27. Klimstra, W.B., et al. (2020) “SARS-CoV-2 growth, furin-cleavage-site adaptation and neutralization using serum from acutely infected, hospitalized COVID-19 patients”. Pré-impressão em bioRxiv doi:(https://doi.org/10.1101/2020.06.19.154930)
  28. Seydoux E., et al. (2020) “Characterization of neutralizing antibodies 1 from a SARS-CoV-2 infected individual”.  Preprint at bioRxiv doi: (https://doi.org/10.1101/2020.05.12.091298)
  29. Noy-Porat, T., et al. (2020) “Tiger team: a panel of human neutralizing mAbs targeting SARS-CoV-2 spike at multiple epitopes”.  Preprint at bioRxiv doi: (https://doi.org/10.1101/2020.05.20.106609)
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