Cas9 Protein

TrueCut Cas9 Protein v2を用いたCRISPRゲノム編集は、一貫して高い編集効率をもたらしており、ヒト初代T細胞における機能的ノックアウトは最大90%に達しました。

図1.TrueCut Cas9 Protein v2およびTrueGuide Synthetic gRNAを使用したT細胞受容体のノックアウト　 ヒト初代T細胞は、Neon Transfection Systemを使用して、TrueCut Cas9 Protein v2およびT細胞受容体アルファ（TRAC）またはベータ（TRBC）領域のTrueGuide Synthetic gRNAを用いてトランスフェクションしました。編集効率は、（A）GeneArt Cleavage Detection Assayおよび（B）Attune NxTフローサイトメーターを用いたT細胞受容体陰性（TCR^-）細胞の%測定により確認しました。両測定とも、ノックアウト効率は、TRACで90%以上、TRBCで80%以上でした。

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TrueCut Cas9 Protein v2は、幅広い遺伝子および細胞株において安定して機能します。

図2.がん細胞における強力な編集効率。3つの遺伝子とネガティブコントロール用のTrueGuide Synthetic gRNAを用意し、TrueCut Cas9 Protein v2と複合体を形成しました。このRNP複合体を、Lipofectamine CRISPRMAX Cas9 Transfection Reagentを使用して、A549、U2OS、MDA-MB231細胞に導入しました。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、GeneArt Genomic Cleavage Detection Assay（GCD）またはIon Torrent次世代シーケンシング（NGS）のいずれかを使用して切断効率（indel %）をテストしました。切断効率は、テストしたすべての遺伝子と細胞株において高い値を示しました。

図3.幅広い細胞種および導入方法で一貫したCRISPR編集効率　 CRISPRMAX試薬またはNeonエレクトロポレーションシステムを使用して、代表的な4種類の細胞である接着細胞株（A549、HepG2）、浮遊細胞（THP1）、一次免疫細胞（初代ヒトT細胞）のトランスフェションを実施しました。RNP複合体は、TrueCut Cas9 Protein v2とTrueGuideポジティブまたはネガティブコントロールsgRNAで構成しました。テストしたすべての細胞種と導入方法において、TrueCut Cas9 Protein v2の高い編集効率が確認されました。

TrueCut Cas9 Protein v2は、他社のCas9酵素と比較して、一貫して最大 2 倍高いゲノム編集効率を示しました。

図4.Invitrogen Cas9と他のCas9酵素との比較　 TrueCut Cas9 Protein v2および対応するTrueGuide Synthetic gRNAを使用してゲノム編集を実施しました。複合体は、最適化されたトランスフェクション プロトコルと Lipofectamine CRISPRMAX Transfection Reagentを使用して、(A) A549細胞株および(B) MDA-MB231細胞株に導入されました。PRKCG-T1やCMPK1-T1のような困難な遺伝子座であっても、他のサプライヤーの製品やプロトコルと比較して、Invitrogenシステムの切断効率は一貫して優れていました。
 

TrueCut HiFi Cas9 Proteinのフィデリティ（特異性またはオフターゲット効果の最小化）と編集効率（オンターゲット編集の成功率）を、TrueCut Cas9 Protein v2および他社ハイフィデリティCas9と比較して評価しました。TrueCut HiFi Cas9は、その優れた能力により、オフターゲット編集を大幅に低減することが確認されました。

問題のある遺伝子座と問題のない遺伝子座の両方の例を含む詳細なデータについては、アプリケーションノートを参照してください。
 

図5.TrueCut HiFi Cas9 Proteinによるヒト初代T細胞での優れたオフターゲットプロファイルNeon Transfection Systemを使用して、21個のgRNAを、野生型TrueCut Cas9 Protein v2、TrueCut HiFi Cas9 Proteinおよび他社のHiFi Cas9とコトランスフェクションしました。オフターゲットの検出には、Ion Torrentに対応したNGSメソッドのTarget-enriched GUIDE-Seq（TEG-Seq）を使用しました。（A）赤色の点は、オンターゲットイベントを100%にノーマライズしたものです。灰色の点はオフターゲットイベントで、これらを対応するオフターゲットとオンターゲットの比率に対してプロットすることにより、各オフターゲットイベントのリスク確率を表示しています。（B）棒グラフは、オフターゲット／オンターゲット比のレベルに応じて、オフターゲット編集の数と重大度を表しています。野生型TrueCut Cas9 Protein v2 および他社のHiFi Cas9と比較して、TrueCut HiFi Cas9 Proteinは、すべての重大度レベルではるかに少ないオフターゲット効果を生じました。

同じ実験において、TrueCut HiFi Cas9のオンターゲット編集効率は、他社のハイフィデリティCas9で観察されたものと同等またはそれを上回り、オフターゲット効果もはるかに少なくなりました。

図6.TrueCut HiFi Cas9タンパク質はヒト初代T細胞において80%を超えるオンターゲット編集効率を維持　 オフターゲット編集がもっとも少ない11個のgRNAのサブセットを使用して、T細胞におけるオンターゲット活性を、インデルおよび相同組み換え修復（HDR）を含めて評価しました。スクリーニングには、Ion Torrent NGSベースのターゲットアンプリコンシーケンスを使用しました。TrueCut Cas9 Protein v2を100%としてノーマライズすると、 TrueCut HiFi Cas9 Proteinは、インデルとHDRにおいて、それぞれ84%と88%の編集効率を達成しました。

人工多能性幹細胞（iPSC）において、TrueCut HiFi Cas9は、野生型Cas9および他社のフィデリティCas9と比較してオフターゲット編集の生成が少なく、個々のオフターゲットでのオフ／オン比も低減されていました。同時に、TrueCut HiFi Cas9タンパク質のオンターゲット編集効率の高さは、テストしたすべてのgRNAで維持されていました。

図7.TrueCut HiFi Cas9 Proteinは、iPSCにおいてオンターゲット編集効率の高さを維持しながら、優れたオフターゲットプロファイルを示すことを実証（A）棒グラフは、オフターゲットが検出された3つの遺伝子について、オンターゲットおよびオフターゲットのRPMを示しています。TrueCut HiFi Cas9は、野生型Cas9および他社のハイフィデリティCas9と同等のオンターゲット効率と高いフィデリティを達成しました。（B）BCL11AとHBB1の両方について、TrueCut HiFi Cas9 ProteinにおけるインデルとHDRの成功率は、野生型TrueCut Cas9 Protein v2と他社のHiFi Cas9のいずれとも同等でした。