Kit EMSA quimioluminiscente LightShift™

El kit EMSA quimioluminiscente Thermo Scientific LightShift es un sistema extraordinariamente robusto y sensible para realizar ensayos electroforéticos de cambio de movilidad (EMSA) para identificar y caracterizar interacciones de unión proteína-ADN. El kit incluye los reactivos para configurar y personalizar las reacciones de unión del ADN, un conjunto de control de extractos de proteínas y ADN para probar el sistema del kit, un conjugado de estreptavidina y peroxidasa de rábano picante (HRP) estabilizado como sonda de cribaje para el objetivo de ADN etiquetado con biotina y un módulo de sustrato quimioluminiscente excepcionalmente sensible para la detección.

Características del kit EMSA quimioluminiscente LightShift:

• Excelente para detectar proteínas de baja abundancia en extractos nucleares
• Sensibilidad que supera los métodos radioactivos y de digoxigenina
• Compatible con condiciones de unión establecidas previamente para interacciones ADN-proteína populares
• Incluye el sistema de control de antígenos nucleares de Epstein-Barr (EBNA) para ayudar a los nuevos usuarios a desarrollar un ensayo de trabajo y a comprender los métodos que se utilizan para confirmar la especificidad de la interacción de unión

El principio de la detección de EMSA LightShift es similar a la inmunotransferencia (western blot). El ADN bicatenario etiquetado con extremos de biotina se incuba con un extracto nuclear o factor purificado y se realiza una electroforesis del mismo en gel natural. A continuación, el ADN se transfiere rápidamente (en 30 minutos) a una membrana de nailon positiva, se entrecruza con UV, se le aplica una sonda de conjugado de estreptavidina-HRP y se incuba con el sustrato. El protocolo, desde el etiquetado hasta los resultados, puede realizarse en un solo día.

La interacción de las proteínas con el ADN es fundamental para el control de muchos procesos celulares, incluida la replicación del ADN, su recombinación y reparación, la transcripción y ensamblaje viral. Una técnica que es fundamental para estudiar la regulación de los genes y determinar las interacciones proteína-ADN es el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA).

La técnica EMSA se basa en la observación de que los complejos proteína-ADN migran más despacio que las moléculas de ADN libre cuando se los somete a una electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida no desnaturalizante. Dado que la tasa de migración del ADN cambia o se retarda tras la unión de proteínas, el ensayo también se denomina de retraso con gel o cambio con gel. Hasta la concepción de EMSA, las interacciones proteína-ADN se estudiaban principalmente mediante ensayos de unión de filtros de nitrocelulosa.

Para realizar el ensayo es necesario un objetivo de ADN purificado con extremo etiquetado con biotina, la prueba del extracto de proteínas, una membrana de nailon y equipos básicos de electroforesis. Los objetivos de ADN se pueden sintetizar con etiquetas 5' o 3' biotina o etiquetarse tras la síntesis con el kit de etiquetado de ADN con extremo de 3' biotina Thermo Scientific (n.º de producto 89818). Los extractos de proteínas nucleares, citosólicas o de células enteras se pueden obtener mediante una amplia variedad de métodos, incluido el kit de reactivos para la extracción citoplasmática y nuclear Thermo Scientific NE-PER (producto n.° 78833).

Más datos del producto
• Geles EMSA de transferencia con el sistema Pierce G2 para efectuar transferencias rápidamente

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