Sequenase Version 2.0 DNA-Polymerase

Beschreibung:
Sequenase™ Version 2.0 DNA-Polymerase ist eine genetisch entwickelte Form der T7 DNA-Polymerase. Anders als das Wildtyp-Enzym besitzt es nahezu keine 3'→5' Exonuklease-Aktivität. Sequenase Version 2.0 ist äußerst prozessiv, inkorporiert Nukleotidanaloge (dlTP, thio-dNTPs, dideoxy-NTPs etc.), wird nicht durch sekundäre Strukturen gehemmt und kann eine Strangverdrängungssynthese ausführen. Es ist ein für die Sanger-Sequenzierung ausgezeichnet geeignetes Enzym und auch für andere Anwendungen nützlich, insbesondere wenn die Abwesenheit von assoziierter Exonuklease-Aktivität erwünscht ist.Sequenase Version 2.0 besitzt zwei Untereinheiten, eine ist das E. coli-Protein Thioredoxin (Molekulargewicht 12.000) und das andere ist die genetisch entwickelte Version des Bakteriophage-T7-Gen-5-Proteins (Molekulargewicht 76.000). Die genetischen Veränderungen in dieser Untereinheit (eine Löschung von 28 Aminosäuren erreicht durch In-vitro-Mutagenese) eliminieren die gesamte messbare Exonuklease-Aktivität, ohne die DNA-Polymerase-Aktivität zu verändern.

Eigenschaften:
Molekulargewicht: Besteht aus zwei Untereinheiten, modifiziertes T7-Gen-5-Protein (76 kDa) und E. coli
Thioredoxin (12 kDa)
Optimaler pH-Wert: 7,5
Optimale Temperatur: 37 °C
Voraussetzungen für divalentes Kation: Mg²⁺, Mn²⁺

Reinheitsgrad:
Reinheitsgrad höher als 95 %, bestimmt durch SDS-PAGE. Getestet auf kontaminierende doppel- und einzelsträngige Endo- und Exonukleasen.

Lagerungspuffer:
20 mM Kaliumphosphat (pH 7,4), 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 50 % Glycerin.

Assaybedingungen:
Das Reaktionsgemisch (100 μl) beinhaltet 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,3 mM dNTPs und 5 μg M13mp18 prä-angelagert an 5 pmol M13 Universalprimer. Das Enzym wird dem vorgewärmten (37 °C) Reaktionsgemisch hinzugegeben; Inkubation ist bei 37 °C für eine Minute.

Einheiten-Definition:
Eine Einheit des Enzyms katalysiert die Überführung von 1 nmol Nukleotid in die säureunlösliche Form in 30 Sekunden bei 37 °C.

Konzentration:
13 Einheiten/μl

Sequenase Verdünnungspuffer (1 ml im Lieferumfang enthalten, Sequenase Dilution Buffer – PN 70765):
10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA.

Literatur:
Tabor, S. and Richardson, C. C. (1989) J. Biol. Chem. 264, 6447-6458.
Wang, D., Coscoy, L., Zylberberg, M., Avila, P. C., Boushey, H. A., Ganem, D. and DeRisi, J. L. (2002) Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99, 15687-15692.
Paris, M. (1992) Comments 18, (No. 3), United States Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio.
Tabor, S. and Richardson, C. C. (1987) Proc.Natl. Acad Sci. USA 84, 4767-4771.
Tabor, S. and Richardson, C. C. (1989) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 86, 4076-4080.