Pierce™ Direct IP Kit

El kit de IP directa Thermo Scientific Pierce utiliza una resina activada para inmovilizar covalentemente anticuerpos IP (cualquier especie o clase) en gránulos de agarosa sin la ayuda de la proteína A/G, lo que permite la inmunoprecipitación sin interferencias de anticuerpos.

Las ventajas principales derivadas de este método son, por una parte, la posibilidad de utilizar cualquier especie o subclase de anticuerpo purificado (sin limitarse a los tipos que se unen a proteína A o G exclusivamente) y la posibilidad de purificar la proteína diana sin que resulte contaminada por el anticuerpo. El método permite también inmunoprecipitar antígenos de muestras de suero sin copurificar inmunoglobulinas que no sean diana. Por último, el kit utiliza cubetas de centrifugado para microcentrífuga para lavar y separar las muestras de la resina de agarosa granulada.

Características del kit de IP directa:

• Requiere menos de 10 µg de anticuerpos: el procedimiento optimizado solo requiere de 2 a 10 µg de anticuerpos para un solo experimento de IP, no más de lo que se requiere para los métodos tradicionales de IP
• Escalabilidad sencilla y eficiente: utilice solamente la cantidad de anticuerpos necesaria para una única de IP o inmovilice 100-200 µg de anticuerpo para preparar resina de afinidad IP lista para usar para muchos experimentos
• Contaminación de anticuerpos mínima: el anticuerpo se une de forma irreversible a los gránulos de agarosa, de forma que se minimiza la coelución de cadenas ligeras y pesadas con la proteína purificada (por ejemplo, menos del 5 %)
• IP con cualquier especie y subclase de anticuerpo: utilice IgY de pollo, IgE humana, IgM de ratón o cualquier otra proteína purificada
• Resina de afinidad de anticuerpos preparada reutilizable: el anticuerpo se inmoviliza covalentemente y no se inactiva por el procedimiento de elución moderado, por lo que a menudo la resina se puede utilizar varias veces
• Manipulación de muestras fácil: las columnas de centrifugación (ver dimensiones) eliminan la pérdida de resina y permiten una separación eficiente de las soluciones
• Kit completo: el paquete incluye tampón de lisis celular y suficientes reactivos y columnas de centrifugación para realizar al menos 50 inmovilizaciones de anticuerpos y experimentos de IP
• Se necesitan anticuerpos purificados: la solución de anticuerpos IP debe estar libre de BSA, gelatina u otras proteínas estabilizadoras; para una fácil eliminación de estas proteínas, consulte nuestro kit de limpieza de anticuerpos (n.º de referencia 44600)

Aplicaciones:
• Inmunoprecipitación seguida por electroforesis y escisión de la proteína para espectrometría de masas o análisis de identificación de secuenciación
• Inmunoprecipitación y análisis SDS-PAGE de una proteína diana cuyo peso molecular sea similar al fragmento de anticuerpos de cadena ligera o pesada
• Inmunoprecipitación de proteínas objetivo para su posterior análisis por métodos no desnaturalizantes (es decir, métodos que no impliquen SDS-PAGE)
• Inmunoprecipitación con anticuerpos que no se unen a la proteína A, proteína G o proteína A/G
• Inmunoprecipitación del suero y otra muestra que contiene inmunoglobulinas

Inmunoprecipitación directa en dos sencillos pasos:

Paso 1: Acople el anticuerpo a la resina de agarosa: El primer paso del método de IP directa consiste en preparar la resina de afinidad con anticuerpo IP. El anticuerpo puro (ver aspectos destacados) se incuba en un tampón de fosfato con el volumen apropiado de resina de acoplamiento AminoLink Plus, una resina de agarosa granulada activada con aldehído. Durante la incubación, distintas épsilon-aminas de lisina presentes en la superficie de la molécula del anticuerpo grande reaccionan con los grupos aldehídos de la resina para formar uniones base de Schiff que luego se estabilizan en uniones de aminas secundarias en presencia de cianoborohidruro. La reacción inmovilizada, conocida como aminación reductiva, es no desnaturalizante y, por lo general, produce una eficacia de acoplamiento de anticuerpos superior al 85 % con una pérdida mínima de la función de unión a antígeno.

Paso 2: Realice experimentos de inmunoprecipitación: Una vez preparada, la resina de anticuerpo se puede utilizar en experimentos de IP ya sea en varias alícuotas paralelas o a la vez. La resina de anticuerpo se incuba con una muestra que contiene el antígeno de la proteína de interés y permite la formación del complejo anticuerpo:antígeno. Después del lavado para eliminar componentes no unidos (presumiblemente no deseados) de la muestra, el antígeno se recupera disociándolo del anticuerpo con el tampón de elución incluido en el kit. Todo el procedimiento se realiza en un vaso de giro de microcentrífuga, permitiendo que las soluciones se separen completamente de la resina de agarosa con una breve centrifugación. Con este procedimiento solo se eluye el antígeno, por lo que puede ser identificado y analizado después sin interferencias de fragmentos de anticuerpo. Además, la resina de anticuerpos se puede reutilizar para realizar rondas adicionales de inmunoprecipitación.

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