Active Rac1 Pull-Down and Detection Kit

Das Thermo Scientific Active Rac1 Pull-Down- und Nachweis-Kit ist ein vollständiges Kit zur selektiven Anreicherung und zum Nachweis von GTP-gebundener Rac1-GTPase durch spezifische Proteininteraktion mit der Pak1-Proteinbindungsdomäne.

Das Active Rac1 Pull-Down- und Nachweis-Kit enthält aufgereinigte GST-Pak1-Proteinbindungsdomäne (PBD), Glutathion-Agaroseharz, positive und negative Kontrollen (jeweils GTPγS und GDP), Lyse-/Bindungs-/Waschpuffer, Anti-Rac1-Primärantikörper, SDS-Probenpuffer, Spin-Säulen und Entnahmeröhrchen. Das Kit wurde mit Lysaten aus NIH-3T3-Zellen validiert, einer Zelllinie, von der bekannt ist, dass sie eine robuste Rac1-Aktivität aufweist.

Merkmale des Active Rac1 Pull-Down- und Nachweis-Kits:

• Hochempfindlich und genau – optimierte Reagenzien, spezifischer Anti-Rac1-Antikörper und Western-Blot-Verfahren gewährleisten genaue Kontrollen und halbquantitative Ergebnisse
• Validiert – funktionell auf Rac1-Nachweis getestet, um Qualität und Leistung zu gewährleisten
• Kompatibel – für eine Vielzahl von Zelltypen von Maus, Ratte und menschlicher Herkunft geeignet

Anwendungen:
• Nachverfolgung der Aktivierung von Rac1-GTPase während der Zelldifferenzierung, -migration, -teilung und zytoskeletalen Neuanordnung
• Untersuchung der Rac1-abhängigen Lamellipodium-Bildung
• Untersuchung der Rolle von aktivem Rac1 bei Krebs und Angiogenese
• Überwachung der Rac1-Aktivität nach Stimulation mit Wachstumsfaktoren
• Screening von Inhibitoren kleiner Moleküle auf ihre Auswirkung auf die Rac1-Aktivität

Die Spezifität und Funktion des Active Rac1 Pull-Down- und Nachweis-Kits für die Anreicherungsmethode mit aktivem Rac1 wurde anhand von mit GTPγS behandelten Zelllysaten zur Aktivierung von endogenem Rac1 validiert und mit GDP-behandelten Lysaten zur Inaktivierung der kleinen GTPase verglichen. Die GTPγS-Behandlung fängt Rac1 in der GTP-gebundenen, aktiven Form ein, was zu einem starken Signal führt, wenn endogenes Ras vorhanden ist. Die GDP-Behandlung treibt Rac1 in den GDP-gebundenen, inaktiven Zustand, was unabhängig von den Rac1-Proteinkonzentrationen zu minimalem bis gar keinem Signal führt. Das Kit ist für den Western-Blot-Nachweis mit einem HRP-konjugierten Sekundärantikörper (Ziege-Anti-Maus-IgG, Art.-Nr. 31430) und Thermo Scientific SuperSignal West Pico Chemilumineszenz-Substrat (Art.-Nr 34080) optimiert. Das Kit enthält genügend Komponenten für 30 Pulldown-Assays.

Informationen zu Rac1:
GTPasen der Rho-Familie haben viele zelluläre Funktionen, einschließlich Zellsignalisierung, Transkriptionsregelung und Organisation des Aktin-Cytoskeletts. Diese Familie von GTPasen umfasst Rho (RhoA, RhoB und RhoC), Rac (Rac1, Rac2, Rac3 und RhoG), Cdc42 (Cdc42 und G25K), Rnd (Rnd1, Rnd2 und RHoE/Rnd3), die RhoBTB-Familie und die Miro-Familie. Diese GTPasen ermöglichen die Signaltransduktion von der Plasmamembran zum Cytosol durch GPCR, Tyrosinkinase, Zytokin und Adhäsionsrezeptoren. Die Anbindung an der Plasmamembran erfolgt durch Geranylgeranyl-Lipidmodifikationen am Carboxyterminus des Proteins. Die Rac1-Aktivierung führt zur Aktin-Polymerisation und zeigt sich durch die Bildung von Membranrüschen an der zellulären Peripherie. Die Rac1-Aktivierung führt auch zur Bildung von Lamelipodien.

Die Rac1-GTPase überträgt Signale durch Tyrosinkinasen, Adhäsionsmoleküle oder Zytokin-/Chemokinrezeptoren nach der Stimulation mit Wachstumsfaktoren (EGF, Insulin, PDGF, NGF), Integrinen (Fibronektin) oder Chemoattraktanten (fMLP). Die Stimulation mit EGF führt beispielsweise zur Aktivierung der PI3-Kinase, was zu Zellwachstum und Reorganisation an der Zellperipherie (Membranrüschen) führt. Alternativ führt die Rezeptor-Tyrosinkinase-Signalgebung durch Rac1 zur Aktivierung der MAPK-Stressreaktionspfade SAPK (JNK) und p38. Die Stimulation von Zellen mit Fibronektin führt zu einer Integrin-vermittelten Zellausbreitung. Zwei der Haupteffektorproteine von Rac1 sind Pak1 und Phosphoinositol-4-Phosphat 5-Kinase. Pak1 (p65 Pak) ist eine Kinase, die den JNK-Weg aktiviert, während die Phosphoinositol-4-Phosphat-5-Kinase die Aktinfilament-Baugruppe fördert. Rac ist für die Entwicklung von T-Zellen und zur Anregung der Zelldifferenzierung wichtig. Die Rho-Familie der GTPasen kann jedoch während der Zellsignalweiterleitung als Agonist und während der Differenzierung als Antagonist wirken.

Weitere Produktdaten
• Messung der Aktivierung kleiner GTPasen über ihre spezifischen nachgelagerten Effektoren
• Nachweis und Lokalisierung aktiver GTPasen in der neuronalen Zelldifferenzierung