Active Arf1 Pull-Down and Detection Kit

Das Thermo Scientific Pierce Active Arf1 Pull-Down- und Nachweis-Kit ist ein vollständiges Kit zur selektiven Anreicherung und zum Nachweis von GTP-gebundener Arf1-GTPase durch spezifische Proteininteraktion mit der GGA3-Proteinbindungsdomäne.

Das Active Arf1 Pull-Down- und Nachweis-Kit enthält aufgereinigte GST-GGA3-Proteinbindungsdomäne (PBD), Glutathion-Agaroseharz, positive und negative Kontrollen (jeweils GTPγS und GDP), Lyse-/Bindungs-/Waschpuffer, Anti-Arf1-Primärantikörper, Probenpuffer, Spin-Säulen und Entnahmeröhrchen. Das Kit wurde mit Lysaten aus MDCK-Zellen validiert, einer Zelllinie, von der bekannt ist, dass sie eine robuste Arf1-Aktivität aufweist.

Merkmale des Active Arf1 Pull-Down- und Nachweis-Kits:

• Hochempfindlich und genau – optimierte Reagenzien, spezifischer Anti-Arf1-Antikörper und Western-Blot-Verfahren gewährleisten genaue Kontrollen und halbquantitative Ergebnisse
• Validiert – funktionell auf Arf1-Nachweis getestet, um Qualität und Leistung zu gewährleisten
• Kompatibel – für eine Vielzahl von Zelltypen von Maus, Ratte und menschlicher Herkunft geeignet

Anwendungen:
• Nachverfolgung der Aktivierung von Arf1-GTPase während der Zelldifferenzierung, -migration, -teilung und zytoskeletalen Neuanordnung
• Untersuchung der Aktivierung von Arf1 bei der Assemblierung von Beschichtungsproteinen auf knospenden Vesikeln oder dem trans-Golgi-Netzwerk und Endosomen
• Überwachung der Arf1-Aktivität nach Stimulation mit Wachstumsfaktoren
• Überwachung der Arf1-Aktivität nach der Inhibitor-Behandlung kleiner Moleküle

Die Spezifität und Funktion des Active Arf1 Pull-Down- und Nachweis-Kits für die Anreicherungsmethode mit aktivem Arf1 wurde anhand von mit GTPγS behandelten Zelllysaten zur Aktivierung von endogenem Arf1 validiert und mit GDP-behandelten Lysaten zur Inaktivierung der kleinen GTPase verglichen. Durch die GTPγS-Aufbereitung wird Arf1 in der GTP-gebundenen Form (aktiv) gebunden, was in Anwesenheit von endogenem Arf1 zu einem starken Signal führt. Die GDP-Behandlung treibt Arf1 in den GDP-gebundenen Zustand (inaktiv), was unabhängig von den Arf1-Proteinkonzentrationen zu minimalem bis gar keinem Signal führt. Das Kit ist für den Western-Blot-Nachweis mit einem HRP-konjugierten Sekundärantikörper (Ziege-Anti-Kaninchen-IgG, Art.-Nr. 31460) und Thermo Scientific SuperSignal West Pico Chemilumineszenz-Substrat (Art.-Nr. 34080) optimiert. Das Kit enthält genügend Komponenten für 30 Pulldown-Assays.

Informationen zu Arf1:
ADP-Ribosylierungsfaktor-Proteine 1 bis 6 (Arfs) sind Mitglieder der Ras-Familie kleiner GTPasen. Obwohl strukturell ähnlich, unterscheiden sich die zellulären Rollen von Arf1-6 von den anderen Arf-Familienmitgliedern. Ihre endogene Rolle ist nicht die ADP-Ribosylierung, sondern die Regulation heterotrimerischer G-Proteine. Die Arf-Proteine lassen sich in drei Klassen unterteilen: Klasse I—Arf 1-3; Klasse II—Arf 4,5; Klasse III—Arf6. Arfs der Klasse I und II sind mit dem Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) verbunden und an der Rekrutierung von Effektorproteinen in die Golgi-Membran und der Bildung von Vesikeln beteiligt. Im Gegensatz zu anderen GTPasen werden Arf-GTPasen durch Myristoylierung am Amino-Terminus modifiziert, um die Einbindung in die Membran zu ermöglichen. Das Klasse-III-Protein Arf6 ist mit der Plasmamembran assoziiert und an der Vesikelbildung an der Plasmamembran, am Vesikelzyklus und am Umbau des Aktin-Cytoskeletts beteiligt.

Obwohl die Arf-GTPasen in allen Zellen exprimiert werden, ist Arf1 die am häufigsten vorkommende, aktivste und am besten charakterisierte. Arf1 rekrutiert seine Effektoren, einschließlich des Coatomer- und Clathrin-Adapterkomplexes (AP), in die Golgi-Membran für die Bildung und Knospung von Vesikeln. Nach der Rekrutierung hält Arf1 die Hüllproteine an der Membran, bis sich das Vesikel gebildet hat. Arf1 interagiert dann mit seinem Effektor, was zur Freisetzung von Arf1 aus der Membran und zur Vesikelknospung führt. Die am Golgi lokalisierten γ-Ohr enthaltenden Arf(GGA)-Effektorbindungsproteine enthalten eine aminoterminale VHS-Domäne, eine GGA-Homologie-Domäne (GGAH), eine Prolin-reiche Linkerregion und eine Carboxy-terminale γ-Ohr-Adaptin-Homologie-Domäne (AGEH). Die VHS-Domäne interagiert mit zytoplasmatischen Domänen zur Rezeptorsortierung, die GGAH-Domäne bindet aktivierten Arf, die prolinienreiche Region interagiert mit Clathrin und die AGEH-Domäne mit zytosolischen Proteinen. Durch Mutationsstudien wurde nachgewiesen, dass die GGAH-Domäne ausreicht, um GTP-gebundenen Arf zu binden, und Arf1 bindet alle drei GGA-Effektorproteine. Die Verbindung der GGA-Proteine mit dem TGN und mit der Plasmamembran wird durch das Arf geregelt.

Weitere Produktdaten
• Aktivierungsmessung kleiner GTPases über ihre spezifischen nachgeschalteten Effektoren