Das Thermo Scientific LightShift EMSA-Optimierungs- und Kontroll-Kit ist ein außerordentlich stabiles und empfindliches System für elektrophoretische Mobilität-Shift-Assays (EMSA) zur Identifizierung und Charakterisierung von Protein-DNA-bindenden Interaktionen. Das Kit enthält Reagenzien zum Einrichten und Anpassen von DNA-Bindungsreaktionen sowie einen Kontrollsatz an DNA- und Proteinextrakt zum Testen des Kit-Systems.

Merkmale des LightShift EMSA-Optimierungs- und Kontroll-Kits:

• Hervorragend geeignet für den Nachweis von Proteinen mit geringem Vorkommen in nuklearen Extrakten
• Empfindlichkeit, die radioaktive und Digoxigenin-Methoden übertrifft
• Kompatibel mit bereits etablierten Bindungsbedingungen für gängige DNA-Protein-Interaktionen
• Beinhaltet das EBNA-Kontrollsystem, das neuen Benutzern bei der Entwicklung eines funktionierenden Assays und dem Verständnis der Methoden hilft, die zur Bestätigung der Bindungsinteraktionsspezifität dient

Das Prinzip für LightShift EMSA-Detektion ähnelt einem Western-Blot. Die mit Biotin endmarkierte Duplex-DNA wird mit einem nuklearen Extrakt oder einem gereinigten Faktor inkubiert und auf einem nativen Gel elektrophoresiert. Die DNA wird anschließend schnell (30 Minuten) zu einer positiven Nylonmembran übertragen, UV-vernetzt, mit Streptavidin-HRP-Konjugat sondiert und mit dem Substrat inkubiert. Das Protokoll von der Markierung bis zu den Ergebnissen kann innerhalb eines Tages fertiggestellt werden.

Die Interaktion von Proteinen mit DNA ist von zentraler Bedeutung für die Kontrolle vieler zellulärer Prozesse, einschließlich DNA-Replikation, Rekombination und Reparatur, Transkription und viraler Assemblierung. Eine Technik, die für die Untersuchung der Genregulation und die Bestimmung von Protein-DNA-Interaktionen von zentraler Bedeutung ist, ist der elektrophoretische Mobilität-Shift-Assay (EMSA).

Die EMSA-Technik basiert auf der Beobachtung, dass Protein-DNA-Komplexe langsamer migrieren als freie DNA-Moleküle, wenn sie nicht denaturierenden Polyacrylamid- oder Agarose-Gelelektrophorese ausgesetzt sind. Da die Geschwindigkeit der DNA-Migration bei Proteinbindung verändert oder verzögert wird, bezeichnet man den Assay auch als Gelshift- oder Gelretardierungsassay. Bis zur Konzeption von EMSA wurden Protein-DNA-Interaktionen hauptsächlich mithilfe Nitrocellulose-Filter-bindende Assays untersucht.

Zur Durchführung des Assays wird nur ein gereinigtes DNA-Ziel benötigt, das mit Biotin, dem zu testenden Proteinextrakt, Nylonmembran und grundlegenden Elektrophoresegeräten endmarkiert wurde. DNA-Ziele können mit 5'- oder 3'-Biotinmarkierungen versehen oder nach der Synthese mit dem Thermo Scientific Biotin 3' End DNA Labeling Kit (Art.-Nr. 89818) markiert werden. Nukleäre, zytosolische oder Gesamtzell-Proteinextrakte können durch verschiedene Methoden gewonnen werden, z. B. mit dem Thermo Scientific NE-PER Reagenzkit für die nukleäre und zytoplasmatische Extraktion (Bestellnr. 78833).

Weitere Produktdaten
• Übertragung von EMSA-Gelen mithilfe des Pierce G2 Fast Blotter

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