Pierce™ RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit

Das Thermo Scientific Pierce RNA 3'-End Desthiobiotinylierungskit enthält Reagenzien für die einfache und effiziente Desthiobiotin-Markierung von RNA zur Verwendung als Sonden oder als Antikörperalternative für die Anreicherung von RNA-bindenden Proteinen.

Merkmale des RNA 3'-End Desthiobiotinylierungs-Kits:

• Nicht radioaktiv – Ein einzelnes Biotin-Etikett hat eine ähnliche Nachweisempfindlichkeit wie Radioaktivität
• Einfache Verwendung – RNA-Ligase und optimierte Reaktionspuffer sind enthalten
• Kostengünstig – synthetische, biotinylierte RNA-Sonden zu nur einem Bruchteil der Kosten
• Endmarkiert – Ergebnisse führen zu minimalen Störungen der RNA-Sekundärstruktur
• Flexibel – Desthiobiotin-Etikett kann zum Nachweis oder als Affinitätsmarker für Streptavidinharz genutzt werden

Das Pierce RNA 3'-End Desthiobiotinylierungskit ist für die Markierung des 3'-Endes einsträngiger RNA mit T4 RNA-Ligase optimiert. Die markierte RNA kann anschließend als Sonde oder Ziel von EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)-Reaktionen, Northern Blots und Experimenten über die Wechselwirkungen zwischen Proteinen und RNA verwendet werden. Die desthiobiotinylierte RNA kann auch zur Anreicherung von RNA-bindenden Proteinen (RBP) dienen. Dazu wird ein Streptavidin-Affinitätsharz verwendet, da die Desthiobiotin-Marker Streptavidin auf eine Weise binden, die eine schonende Elution des Ribonukleinproteinkomplexes erlaubt. Das Beschriftungskit ist auch Bestandteil des Thermo Scientific Pierce Magnetischen RNA-Protein Pull-Down-Kits.

Enthält:
Desthiobiotinyliertes Zytidin-Bisphosphat, T4 RNA-Ligase und Puffer, nicht markiertes RNA-Oligonukleotid zur Verwendung als Positivkontrolle, einen biotinylierten RNA-Sondenstandard, RNase-Inhibitor, Glykogen und ligationsfördernde Reagenzien

Anwendungen:
•Northern Blotting
•EMSA
• Anreicherung von RNA-bindenden Proteinen (RBP)

Dieses RNA-Beschriftungskit verwendet T4 RNA-Ligase, um ein einzelnes dethiobiotinyliertes Zytidin-Bisphosphat am 3'-Ende einer einsträngigen RNA anzubinden. Jede Markierungsreaktion ist für 50 pmol RNA vorgesehen; bei Bedarf ist der Maßstab der Reaktionen modifizierbar (1 pmol bis 1 nmol wurden getestet). Bei der Reaktion wird ein 20-facher Überschuss des desthiobiotinylierten Nukleotids verwendet. Die Inkubationsdauer beträgt von 30 min bei 37 °C (bei RNA mit geringer Komplexität) bis über Nacht bei 4 bis 16 °C (bei RNA mit größerer Länge oder Komplexität). Die Effizienz der Markierung von komplexen RNA-Strukturen kann durch Änderung des Verhältnisses von RNA zu Nukleotid, durch Verlängerung der Inkubationsdauer oder durch Zusatz von DMSO zur Entspannung der RNA-Struktur optimiert werden. Nach organischer Extraktion und Ausfällung mit Ethanol ist die mit Desthiobiotin markierte RNA für den Einsatz in nachgelagerten Anwendungen bereit.

Beispielexperimente mit verschiedenen RNA-Molekülen zeigen die Robustheit der Ligationsreaktion. Synthetische und in vitro-transkribierte RNA wurden getestet und die Ligationseffizienzen wurden im Rahmen semiquantitativer Dotblots ermittelt. Dabei diente eine synthetische, biotinylierte RNA als 100 %-ig markierte Kontrolle (Tabelle). Die Ligationseffizienzen lagen alle über 50 % und viele über 70 %. Die Kontroll-RNA des Kits mit einer Effizienz über 90 % dient als Indikator für die Reaktionsbedingungen und den Zustand der Reagenzien insgesamt. Für RNA mit signifikanter Sekundärstruktur war eine weitere Optimierung erforderlich, und für in vitro-transkribierte RNA nach der Ligation war eine Umfaltung erforderlich.

Ein Pulldown-Assay mit der Interaktion let-7 miRNA:Lin28 demonstriert die experimentelle Funktionalität von desthiobiotinyliert-markierter RNA. Das während der Entwicklung regulierte Lin28-Protein ist ein selektiver Inhibitor der durch let-7 miRNA vermittelten Vorgänge, da es an eine Schleifenregion der let-7 pre-miRNA bindet. Um diese Interaktion zu testen, wurde das Ende der Schleifenregion von let-7 miRNA mit desthiobiotinyliertem Cytidin markiert und an magnetische Streptavidin-Beads angelagert. Die Beads wurden anschließend mit Embryonalkarzinom-Zelllysat (NCCIT) in Protein-RNA-Bindungspuffer inkubiert. Die Proben wurden eluiert und in Western Blots getestet. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die markierte let-7-miRNA speziell Lin28-Protein aus dem NCCIT-Lysat anreichert, während unverwandte RNA dies nicht tut.

Dieses Kit ist außerdem Bestandteil des magnetischen Pierce RNA-Protein-Pull-Down-Kits und verwendet das Kennzeichnungskit zusammen mit optimierten Bindungs-, Wasch- und Elutionspuffern, um RNA-bindende Proteine anzureichern.