Pierce™ BCA Protein Assay Reagenz A

BCA Protein Assay Reagenz A ist ein Bestandteil des Pierce BCA Protein Assay-Kits. Dieser zweiteilige, höchst präzise und Detergenz-kompatible Assay dient zur Messung der Gesamtproteinkonzentration verglichen mit einem Proteinstandard. Pierce BCA Reagenzien ermöglichen die präzise Bestimmung der Proteinkonzentration bei den meisten in der Proteinforschung vorkommenden Probentypen. Der Pierce BCA Assay kann zum Beurteilen der Ausbeuten in Gesamtzell-Lysat und affinitätsisolierten Säulenfraktionen, aufgereinigten Proteinproben sowie zur Überwachung der Protein-Kontamination in Industrieanwendungen verwendet werden. Im Vergleich zu den meisten Farbstoffbindungsmethoden wird der BCA-Assay deutlich weniger durch Unterschiede bei der Proteinzusammensetzung beeinflusst, was eine höhere Konzentrationsgenauigkeit ermöglicht.

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Merkmale des Pierce BCA Protein Assay-Kits (Reagenzien A und B):
• Kolorimetrisch — Visuelle Schätzung oder Messung mit einem Standard-Spektrophotometer oder Plattenlesegerät (562 nm)
• Gleichförmigkeit — Weniger Schwankungen zwischen verschiedenen Proteinen als bei Farbstoff bindenden Verfahren (Bradford)
• Kompatibel — Unempfindlich gegen typische Konzentrationen der meisten ionischen und nicht ionischen Detergenzien
• Testdauer — 30 Minuten Inkubation; viel einfacher und 4-mal schneller als klassische Lowry-Methoden
• Assay-Bereich — Linearer Arbeitsbereich für BSA von 20 bis 2.000 µg/ml
• Empfindlich — Präzise Detektion auf bis zu 5 µg/ml mit dem erweiterten Protokoll

Funktionsweise
Der BCA Protein Assay kombiniert die weitläufig bekannte Reduktion von Cu²⁺ zu Cu¹⁺ durch Protein in einem alkalischen Medium mit dem hochempfindlichen und selektiven kolorimetrischen Nachweis von Kupfer-Kationen (Cu¹⁺) durch Bicinchoninsäure (BCA). Der erste Schritt besteht in der Chelatisierung von Kupfer mit Protein in einer alkalischen Umgebung zur Ausbildung eines hellblauen Komplexes. In dieser als Biuretreaktion bekannten Reaktion bilden Peptide, die drei oder mehr Aminosäurereste enthalten, einen farbigen Chelatkomplex mit Kuperionen in einer alkalischen Umgebung, die Natriumkaliumtartrat enthält.

Im zweiten Schritt der Farbentwicklungsreaktion reagiert BCA mit dem reduzierten (Kupfer-)Kation, das in Schritt 1 gebildet wurde. Das intensiv violett gefärbte Reaktionsprodukt entsteht aus der Chelatisierung zweier BCA-Moleküle mit einem Kupferion. Der BCA-Kupfer-Komplex ist wasserlöslich und zeigt bei zunehmender Proteinkonzentration bei 562 nm eine starke lineare Extinktion. Der Komplex ist etwa 100-mal empfindlicher (untere Nachweisgrenze) als die hellblaue Farbe der ersten Reaktion.

Die Reaktion wird stark durch vier Aminosäurereste (Cystein, Cystin, Tyrosin und Tryptophan) in der Aminosäuresequenz des Proteins beeinflusst. Anders als bei den Coomassie-Farbbindungsmethoden trägt das universelle Peptidrückgrat auch zur Farbbildung und somit zur Minimierung von Schwankungen infolge der Proteinzusammensetzung bei.

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