TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kit

Das TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C_T Kit ermöglicht eine Expressionsanalyse direkt anhand kultivierter Zellen ohne RNA-Aufreinigung. Das Protokoll enthält einen Zwischenamplifikationsschritt (Voramplifikation) zwischen reverser Transkription und Real-Time PCR, bei dem cDNA angereichert wird für bis zu 100 Genziele der Wahl ohne Amplifikationsverzerrung.

• Vollständige, validierte Lösung – optimierter Arbeitsablauf umfasst Zelllysereagenzien, DNase, RT-Reagenzien, PreAmp Reagenzien und TaqMan™ Genexpression Mastermix
• Schnell, einfach und bequem – Vorbereitung von Proben in 7 Minuten; Eliminierung mühsamer RNA-Isolierung
• Strecken begrenzter Proben – Erhöhung des Echtzeit-PCR-Potenzials bis auf das 64fache; gleichzeitige Untersuchung von bis zu 100 Genen
• Genaue Ergebnisse – einheitliche Amplifikation ohne Einführung von Verzerrung
• Robuste Leistung – linearer Nachweis von 10 bis 100.000 Zellen; Ergebnisse äquivalent zu gereinigter RNA

Komplette, validierte Lösung

Das TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kit bietet eine einzigartige Methode zum Lysieren kultivierter Zellen bei gleichzeitiger Entfernung genomischer DNA und Erhaltung der RNA-Integrität und enthält Reagenzien für die reverse Transkription (RT) für die cDNA-Synthese, TaqMan™ PreAmp Mastermix für die Voramplifikation von bis zu 100 Genzielen und TaqMan™ Genexpression Mastermix für die Echtzeit-PCR-Analyse.

Einfache, praktische 7-minütige Probenvorbereitung

Das TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kit enthält ein einfaches 7-minütiges Probenvorbereitungsverfahren (Abbildung 1) für die Verwendung mit 10 – 100.000 kultivierten Zellen⁄Probe. Die Zellen werden in PBS gewaschen und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in Lösung lysiert; die DNase-Behandlung kann gleichzeitig erfolgen. Die Lyse wird bei Raumtemperatur durch 2-minütige Inkubation mit Stopplösung beendet.

Das Lysat ist nun bereit für die reverse Transkription oder Lagerung bei -20 °C. Da Proben direkt in Kulturplatten (96 oder 384 Wells) verarbeitet werden können, werden Arbeitsaufwand, Probenverluste oder Transferfehler minimiert, während die Erweiterung von begrenzten Proben erleichtert wird. Kein Erhitzen, Waschen oder Zentrifugieren erforderlich; das Kit vereinfacht einen traditionell zeit- und arbeitsintensiven Prozess erheblich und reduziert ihn auf 7 Minuten.

Streckung begrenzter Proben — Erhöhung des Echtzeit-PCR-Potentials bis auf das 64fache

Die Integration der Cells-to-C_T™ Technologie mit Vorverstärkungsfunktion optimiert einen mehrstufigen Arbeitsablauf und erhöht deutlich die Anzahl der bei wertvollen Proben möglichen PCR-Reaktionen (auf mehr als das 60fache). Außerdem wird die Empfindlichkeit des mRNA-Nachweises bei kleinen Probenmengen erhöht.

Die Standard-Real-Time PCR-Reaktion für die Genexpressionsanalyse beginnt mit der reversen Transkription der Gesamt-RNA in cDNA unter Verwendung von Random-Primern und Oligo(dT), gefolgt von der Real-Time PCR unter Verwendung genspezifischer Primer und Sonden (Abbildung 2). Mit dem TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kit wird ein Zwischenamplifikationsschritt (Voramplifikation) zwischen reverser Transkription und Real-Time PCR durchgeführt, bei dem cDNA angereichert wird für bis zu 100 Genziele der Wahl ohne Amplifikationsverzerrung. Die resultierende voramplifizierte Reaktion wird verdünnt und dient als Ausgangsmaterial für die nachfolgenden individuellen TaqMan™ Genexpressions-Assays unter Verwendung des im Kit enthaltenen TaqMan™ Genexpressions-Master Mix. Der TaqMan™ PreAmp Prozess streckt die Proben effektiv auf das 64fache und ermöglicht so Analysen, die bei begrenztem Probenmaterial bisher nicht möglich waren.

Genaue Ergebnisse — gleichmäßige Amplifikation ohne Einführung von Verzerrung

Die Fähigkeit, eine zuverlässige und einheitliche Voramplifikation durchzuführen, ist für die Genexpressionsanalyse bei begrenzten Proben von entscheidender Bedeutung. Obwohl andere Methoden für die Voramplifikation von RNA oder cDNA verfügbar sind, verwenden diese unspezifisches Priming zur Amplifikation des Ausgangsmaterials, was zu einer verzerrten und ungenauen Amplifikation einiger Transkripte gegenüber anderen führt. Der TaqMan™ PreAmp Mastermix, Teil des TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kits, verwendet genspezifische Primer zur Voramplifikation von cDNA und führt so zu einer unverzerrten Amplifikation. Das TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kit bietet eine unverzerrte Voramplifikation, die mit gereinigter RNA im Vergleich zu 100 verschiedenen TaqMan Genexpressionsassays vergleichbar ist. Wie in Abbildung 3 gezeigt, führt die Vorverstärkungsreaktion weder zu einer Verzerrung von Cells-to-C_T™ Lysaten noch zu gereinigten Proben; ≥ 92 % der Assays lagen innerhalb von +⁄– 1,5 ΔΔ CT für voramplifizierte oder nicht amplifizierte cDNA aus gereinigten RNA (A) oder von Cells-to-C_T™ Kit-Lysaten (B).

— Solide Leistungsergebnisse, die mit denen von gereinigter RNA gleichwertig sind
Die Leistung des TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kits wurde mit 100 verschiedenen TaqMan™ Assays unter Verwendung von Cells-to-C_T™ Lysaten oder gereinigter RNA mit oder ohne Vorverstärkung bewertet. Wie in Abbildung 4 dargestellt, waren die mit TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kit Lysaten erhaltenen CT-Werte entweder vor (A) oder nach der Voramplifikation (B) gleichwertig und häufig besser als die mit gereinigter RNA erhaltenen CT-Werte. Die hohe Leistungsfähigkeit von TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kit-Lysaten kann auf die Konservierung von RNA in den Ausgangsproben ohne Verlust durch Erhitzen, Transfer oder Adsorption an Matrizen zurückgeführt werden.

Linearer Nachweis von 10 bis 100.000 Zellen

Jeder Schritt eines Arbeitsablaufs für die RNA-Profilierung muss robust sein, damit er bei wenigen oder vielen Zellen funktioniert. Das TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kit wurde optimiert, um eine effiziente Linearität über fünf Größenordnungen zellulärer Eingabemengen von 10 – 100.000 Zellen pro Lysereaktion zu erzeugen (Abbildung 5). Zur Maximierung der Empfindlichkeit kann beim TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kit bis zu 45 % des RT-Reaktionsvolumens aus Probenlysat bestehen. Das TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kit bietet maximale Empfindlichkeit, die aus dem in der RT-Reaktion verwendeten großen Lysatvolumen, optimierten RT-Reaktionsbedingungen und Voramplifikation der Probe vor der Echtzeit-PCR resultiert.

Bewährte Leistung, bewährte Kombination

Alle Komponenten des TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kits wurden für konsistente und zuverlässige Leistung optimiert. Dadurch entfällt das Rätselraten bei der Zusammenstellung separater Kits für Probenvorbereitung, RT, Voramplifikation und Echtzeit-PCR. Für zusätzliche Qualitätssicherung wurde das TaqMan™ PreAmp Cells-to-C_T™ Kit mit TaqMan™ Genexpressionsassays validiert.