Das TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C_T™ Kit macht es möglich, eine Expressionsanalyse direkt anhand kultivierter Zellen ohne RNA-Aufreinigung durchzuführen. Dieses Kit spart Zeit und überzeugt durch einen einfachen Arbeitsablauf, der für geringere Probenmengen geeignet ist, sich aber auch problemlos in automatisierte Anwendungen mit hohem Durchsatz integrieren lässt.

Vorteile des TaqMan™ Cells-to-C_T Genexpressions-Kits:

• Umfassend – optimierter Arbeitsablauf umfasst Zelllyse-Reagenzien mit gDNA-Entfernung, RT-Enzymgemisch, Puffer und den neuen TaqMan™ Genexpressions-Mastermix
• Schnell – Probenvorbereitung bei Raumtemperatur innerhalb von 7 Minuten, einschließlich DNase-Behandlung
• Einfach – Lyse der Proben in einem Röhrchen oder direkt in Kulturplatten
• Verlässlich – Genexpressionsanalysen mit 10 – 100.000 Zellen pro Probe; Ergebnisse wie bei aufgereinigter RNA
• Effizient – enthält genügend Reagenzien für 500 Echtzeit-PCR-Ergebnisse von 100 Ausgangsproben

Das TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C_T™ Kit bietet eine einzigartige Methode für die Lyse kultivierter Zellen bei gleichzeitiger Entfernung genomischer DNA und Erhaltung der RNA-Integrität. Das Kit enthält Reagenzien für die reverse Transkription (RT) für die cDNA-Synthese und den TaqMan™ Genexpressions-Mastermix für die Echtzeit-PCR-Analyse. TaqMan™ Primer-⁄Sondensätze sind separat erhältlich.

Einfache Probenvorbereitung in 7 Minuten: Teil eines umfassenden Arbeitsablaufs
Egal, ob Sie Platten oder Röhrchen verwenden, das TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C_T™ Kit, das ein einfaches, 7-minütiges Probenvorbereitungsverfahren (siehe Abbildung) verwendet, ist für 10 – 100.000 kultivierte Zellen⁄Probe ausgelegt. Die Zellen werden in PBS gewaschen und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur in Lösung lysiert; die DNase-Behandlung kann gleichzeitig erfolgen. Die Lyse wird bei Raumtemperatur durch 2-minütige Inkubation mit Stopplösung beendet. Das Lysat ist nun bereit für die reverse Transkription oder Lagerung bei -20 °C. Da Proben direkt in Kultur-Wells (96- oder 384-Well) verarbeitet werden können, werden Arbeitsaufwand, Probenverluste oder Transferfehler bei schneller Verarbeitung mit hohem Durchsatz minimiert. Im Gegensatz zu altmodischen RNA-Isolierungsprotokollen mit mehreren Schritten sind weder Erwärmung, Waschen noch Zentrifugation erforderlich. Das Kit verkürzt einen mühsamen Prozess von ansonsten 30 – 60 Minuten auf nur 7 Minuten.

Der Arbeitsablauf des TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C_T™ Kits ermöglicht eine unübertroffene Bewertung der Genexpression mit einem der > 700.000 TaqMan™ Genexpressions-Assays. Dieses Kit wurde ausgiebig mit einer breiten Auswahl an TaqMan™ Genexpressions-Assays auf seine Spezifität getestet und zeigt eine mit gereinigter RNA vergleichbare Leistung (siehe Abbildung).

Unübertroffene Leistung und Empfindlichkeit
Im Gegensatz zu einigen Kits von Mitbewerbern, die die Menge an Lysat in der RT-Reaktion auf 5 % begrenzen, kann das TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C_T™ Kit 45 % des gesamten RT-Reaktionsvolumens als Zelllysat aufnehmen. Außerdem kann die cDNA bis zu 45 % des Real-Time PCR-Reaktionsvolumens ausmachen. Das große Lysatvolumen in der optimierten RT-Reaktion zusammen mit dem großen cDNA-Volumen in der nachfolgenden Real-Time PCR mittels TaqMan™ Gene Expression Master Mix bedeuten maximale Sensitivität. Der Mastermix amplifiziert das Ziel präzise und genau und ermöglicht so den Nachweis kleiner Zielmengen, wie z. B. Transkripte, die in niedrigen Konzentrationen exprimiert werden.

Die Fähigkeit, geringe Zielmengen zu erkennen, wurde durch Mischen einer konstanten Anzahl humaner Zellen mit einer unterschiedlichen Anzahl an Zellen von Mäusen getestet. Die Zellmischungen wurden präpariert mit TaqMan™ Gene Expression Cells-to-C_T™ und auf mausspezifische und humanspezifische Gene untersucht. Vergleichsdaten wurden auf dieselbe Weise generiert, wobei RNA mittels traditioneller Methoden gereinigt wurde. Die Daten zeigen, dass RNA von nur 10 Mäusezellen in einem RNA-Hintergrund von 10.000 Humanzellen nachgewiesen werden konnte (siehe Abbildung). Die Fähigkeit des TaqMan™ Genexpression Cells-to-C_T™ Kit, Transkripte relativ niedriger Abundanz zu erkennen, war mit der von gereinigter RNA vergleichbar; bei niedrigen Konzentrationen war sie überlegen.

Darüber hinaus wurde die Leistung des TaqMan™ Genexpression Cells-to-C_T™ Kits mit den Lysat-Kits von Mitbewerbern und gereinigter RNA verglichen. Eingabemengen von 100 – 100.000 Zellen pro Lysereaktion wurden geprüft. Die Protokollempfindlichkeit des TaqMan™ Cells-to-C_T™ Kits entsprach der von gereinigter RNA und übertraf die der Lysate von Mitbewerbern (siehe Abbildung). Darüber hinaus zeigen die fehlende Hemmung bei Eingabe großer Zellmengen und die geringe Variation bei technischen Replikaten die Zuverlässigkeit dieses Ansatzes für Genexpressionsstudien mit kultivierten Zellen.

Bewährte Leistung, bewährte Kombination
Alle Komponenten des TaqMan™ Genexpression Cells-to-C_T™ Kits wurden für eine konsistente und zuverlässige Leistung optimiert. Kein Rätselraten mehr bei der Zusammenstellung separater Probenvorbereitungs-, RT- und real-time PCR-Kits. Zudem wurde das TaqMan™ Genexpression Cells-to-C_T™ Kit mit TaqMan™ Genexpressionsassays für zusätzliche Qualitätssicherung validiert.

Zubehörprodukt
Das TaqMan™ Cells-to-C_T™ Kontroll-Kit wurde für die Verwendung mit dem TaqMan™ Genexpression Cells-to-C_T™ Kit entwickelt. Dieses Kit enthält eine endogene Kontrolle (ACTB) zur Normalisierung der Probenbeladungsvariabilität und eine künstliche XenoRNA™ Kontrolle und einen entsprechenden TaqMan™ Genexpressionsassay zur Überwachung der Auswirkungen der PCR-Inhibition.