Das cAMP-Screen Direct™ 96-well Cyclic AMP Immunassay-System ermöglicht die ultraempfindliche Bestimmung zyklischer AMP(cAMP)-Konzentrationen in Zelllysaten. Dieser kompetitive Chemolumineszenz-Immunassay bietet extreme Flexibilität für eine manuelle Reagenzienzugaben oder die automatisierte Verarbeitung mit hohem Durchsatz. Der cAMP-Assay verwendet das hochempfindliche chemolumineszente CSPD™ Substrat mit Saphire-II™ Enhancer, das durch ein Enzymkonjugat aus an alkalischer Phosphatase gebundenem cAMP (cAMP-AP) ausgelöst wird. Die Chemolumineszenz-Substrat/Enhancer-Formulierung ist ein gebrauchsfertiges Reagenz, das ab 30 Minuten nach der Zugabe eine anhaltende Glimmlichtemission erzeugt. Dieser Assay wird hauptsächlich für das sekundäre Screening und die präklinische Forschung verwendet, wo Sensitivität und keine falsch-positiven Ergebnisse erforderlich sind.

• Höchste Sensitivität aller handelsüblichen cAMP-Assays
• Stundenlange Lesezeit ohne oder mit nur geringem Signalverlust
• Ein einfaches Protokoll mit direktem Zellwachstum auf der Assayplatte
• Nützlich für eine Vielzahl von Rezeptoraktivierungsstudien

Hohe Sensitivität und über Stunden anhaltende Glimmdauer
Dieser Chemolumineszenz-Assay wurde mit dem Ziel der höchsten Sensitivität aller handelsüblichen cAMP-Assays entwickelt. Es können Mengen von nur 60 Femtomol cAMP nachgewiesen werden. Der Assay verfügt über einen breiten dynamischen Bereich, der 0,06 bis 6.000 Pikomol cAMP erkennt, ohne dass Proben verdünnt werden müssen oder Verfahren wie Acetylierung erforderlich sind. Dies ist besonders bei der Messung der Stimulation und/oder Hemmung von Gs- oder Gi-gekoppelten Agonisten oder Antagonisten in zellbasierten Assays hilfreich. Die Intra-Assay-Präzision bei Doppelproben beträgt in der Regel 5 % oder weniger. Sobald die Substrat-/Verstärkerformulierung das Glimmsignal erreicht hat, kann die Platte stundenlang ohne oder mit nur geringer Verschlechterung des Signals abgelesen werden. Dies ist nützlich bei Untersuchungen, bei denen mehrere Platten miteinander verglichen werden. Darüber hinaus weist der Assay eine außergewöhnlich geringe Kreuzreaktivität mit anderen Adenosin-haltigen oder zyklischen Nukleotiden auf.

Für Rezeptoraktivierungsstudien
Das cAMP-Screen Direct™ System wurde zur Quantifizierung zellulären cAMP für funktionelle Rezeptoraktivierungsassays entwickelt. Der Assay wurde mit gängigen Zelllinien für funktionelle Messungen mit endogenen Rezeptoren, Zelllinien mit exogenisch exprimierten Ligandenrezeptoren auf der Zelloberfläche, Primärzellkulturen und Geweben als Reaktion auf die Behandlung mit den entsprechenden Liganden verwendet. Darüber hinaus wurde es für die Rezeptorcharakterisierung, die Identifizierung des Liganden von Orphan-Rezeptoren und die Charakterisierung neuartiger chimärer Rezeptoren verwendet. Der Assay kann für Hochdurchsatz-Screens von Verbindungen verwendet werden, die diese Signalübertragungswege stimulieren oder stören.

Ein einfaches Protokoll—Kein Lysat-Transfer erforderlich
Der Assay folgt einem einfachen Protokoll. Die Zellen werden in Platten gesät, kultiviert und nach Bedarf mit Testverbindungen behandelt. Zelllysate werden entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von Kulturmedien hergestellt. Lysate werden mit einem cAMP-AP-Konjugat und einem Anti-cAMP-Antikörper in einer beschichteten Mikrotiterplatte inkubiert; die resultierenden Immunkomplexe werden in der Platte erfasst. Bei Proben ohne cAMP wird das gesamte cAMP-AP-Konjugat auf der beschichteten Oberfläche erfasst, was zu einem hohen Signal führt. In Gegenwart von cAMP nimmt die Menge des aufgenommenen cAMP-AP-Konjugats infolge des Bindungswettbewerbs mit dem nicht markierten cAMP ab, was zu einem reduzierten Signal führt. Die Signalreduktion ist proportional zur Menge des im Zelllysat vorhandenen cAMP. Nach dem Waschen zum Entfernen des ungebundenen cAMP-AP wird das Chemolumineszenz-Substrat hinzugefügt, und das resultierende Glimmsignal wird in einem Luminometer gemessen.

Dieses cAMP-Screen Direct™ System bietet alle Vorteile des cAMP-Screen™ Systems, macht jedoch die Übertragung von Zelllysaten von einer Gewebekulturplatte auf die vorbeschichteten Mikrotiterplatten überflüssig, da die Zellen direkt in den Mikrotiterplatten wachsen können. Dies ermöglicht eine bessere Assay-Präzision mit einem einzigen Transferschritt. Viele verschiedene Zelltypen wurden erfolgreich auf den vorbeschichteten Mikrotiterplatten kultiviert, die auch einen klaren Boden haben, um die Überwachung von Zellen zu ermöglichen.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für therapeutische oder diagnostische Zwecke bei Menschen oder Tieren vorgesehen.