Das Ambion™ Single Cell-to-C_T™ Kit enthält einen vollständigen validierten Arbeitsablauf für die Genexpressionsanalyse von Proben mit 1–10 Zellen. Jedes Kit enthält Reagenzien für die Probenvorbereitung, reverse Transkription, Preamplifikation und qPCR, die optimiert und in einem einfachen Arbeitsablauf kombiniert wurden, der in nur 5 Schritten durchgeführt werden kann (siehe Abbildung).

Wichtigste Produktmerkmale:

• Voroptimierter Arbeitsablauf für Echtzeit-RT-PCR aus Einzelzellen
• Maximale Empfindlichkeit für Einzelzellanalysen
• Hervorragende Leistungsfähigkeit und Reproduzierbarkeit im Vergleich zu anderen Methoden
• Umfassendes Kit und leicht verständliches Protokoll

Ein voroptimiertes Protokoll gewährleistet Erfolg und spart Zeit
Jeder Arbeitsablauf beginnt mit einer einfachen 7-minütigen Probenvorbereitung, bei der Zellen effektiv und reproduzierbar mit minimaler Verarbeitung in eine Lösung lysiert werden, die mit nachgelagerter RT-PCR kompatibel ist, ohne dass eine Aufreinigung erforderlich ist. Anschließend werden SuperScript™ RT für die reverse Transkription, TaqMan™ PreAmp Master Mix zur Amplifikation der cDNA und TaqMan™ Gene Expression Master Mix für die qPCR eingesetzt. Diese vier Schritte wurden für eine maximale Empfindlichkeit entwickelt. Die gesamte Zellprobe wird während des gesamten Verfahrens in demselben Well aufbewahrt, um einen Probenverlust oder eine Verdünnung des wertvollen begrenzten Materials zu verhindern, wodurch die Empfindlichkeit beeinflusst werden könnte.

Einzelzell-Empfindlichkeit
Die Empfindlichkeit von Echtzeit-PCR-Ergebnissen kann durch die Effizienz der Probenvorbereitung, reversen Transkription oder Amplifikation beeinflusst werden. Das Single Cell-to-C_T™ Kit ist auf jeden dieser potenziellen Problembereiche ausgelegt und gewährleistet so eine zuverlässige und fundierte Genexpressionsanalyse von Einzelzellen mit maximaler Empfindlichkeit. Der Nachweis von Einzelzelläquivalenten mit dem Single Cell-to-C_T™ Kit zeigt eine geeignete Linearität und Empfindlichkeit von qPCR-Ergebnissen im Vergleich zu einer 100-Zellen-Probenkontrolle mit ausgezeichneter technischer Reproduzierbarkeit (siehe Abbildung). Wie erwartet weisen Einzelzellen aufgrund der inhärenten biologischen Heterogenität eine größere Variabilität auf. Darüber hinaus werden durch einen zusätzlichen cDNA-Preamplifikationsschritt interessante Targets vor der Echtzeit-PCR präzise amplifiziert. Dieser entscheidende Schritt verstärkt das Signal, ohne es zu verzerren, und steigert das Analysepotenzial begrenzter Proben. Die Genauigkeit und Signalverstärkung eines 96-Gen-Panels mit Voramplifikation ist dargestellt (siehe Abbildung).

Hervorragende Leistung und Reproduzierbarkeit im Vergleich zu alternativen Methoden
Herkömmliche Probenvorbereitungsverfahren mit organischen Lösungsmitteln, Glasfaserfiltern oder magnetischen Beads eignen sich aufgrund des Verlusts der Probe durch unvollständige RNA-Fällung, Bindung und Elution nicht für Einzelzellanalysen. Darüber hinaus sind die meisten selbst angefertigten Einzelzell-Methoden, bei denen Zellen durch einfaches Sieden lysiert werden, nicht in der Lage, endogene RNasen zu inaktivieren, um die Genexpressionsprofile zu stabilisieren. Dies kann zu einer chemischen Spaltung der RNA und zu einer Übertragung von Inhibitoren führen, unter Umständen auch zu einer gDNA-Kontamination, die alle qRT-PCR-Anwendungen beeinträchtigen können. Im Gegensatz dazu zeichnet sich das Single Cell-to-C_T™ Kit im Vergleich zu herkömmlichen Aufreinigungs- oder selbst angefertigten Siedemethoden durch hervorragende Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit aus (siehe Abbildung).