Apo-Direct Apoptosis Detection Kit

Das APO-DIRECT™ Kit ist eine 2-farbige Färbungsmethode für das Markieren von Brüchen in der DNA und zellulärer Gesamt-DNA, um apoptotische Zellen durch eine Durchflusszytometrie nachzuweisen. Das Kit beinhaltet die Anleitungen und Reagenzien, die für das Messen der Apoptose in Zellen notwendig sind, einschließlich positiver und negativer Kontrollzellen zur Beurteilung der Reagenzleistung, Wasch-, Reaktions- und Bindepuffer für das Durchführen einzelner Schritte im Assay, terminale Desoxyribonukleotidyltransferase-Enzym (TdT), Fluoresceindeoxyuridintriphosphat und Propidiumiodid/RNase A-Lösung für die Kontrastfärbung der Gesamt-DNA.

Eines der am einfachsten zu messenden Merkmale apoptotischer Zellen ist die Aufspaltung der genomischen DNA durch zelluläre Nukleasen. Diese DNA-Fragmente können aus apoptotischen Zellen extrahiert werden und führen zum Auftreten von DNA-Leitern, wenn die DNA durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert wird. Die DNA nicht-apoptotischer Zellen, die weitgehend intakt bleibt, zeigt dieses Laddering auf Agarosegelen während der Elektrophorese nicht. Die große Anzahl von DNA-Fragmenten, die in apoptotischen Zellen auftreten, führt zu einer Vielzahl von 3'-Hydroxyltermini in der DNA. Diese Eigenschaft kann verwendet werden, um apoptotische Zellen zu identifizieren, indem die 3'-Hydroxyl-Enden mit direkt konjugiertem Fluoresceindesoxyuridintriphosphat-Nukleotiden (FITC-dUTP) markiert werden. Das Enzym Terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT) katalysiert eine vorlagenunabhängige Zugabe von Desoxyribonukleosid-Triphosphaten zu den 3'-Hydroxyl-Enden von Doppel- oder einzelsträngiger DNA mit stumpfen, vertieften oder überhängenden Enden. Apoptotische Zellen haben eine erhebliche Anzahl dieser Stellen, was die Grundlage für die im APO-DIRECT™ Kit verwendete Methode darstellt. Nicht-apoptotische Zellen enthalten aufgrund des Fehlens exponierter 3'-Hydroxyl-DNA-Enden keine signifikanten Mengen von FITC dUTP.

Es werden ausreichend Reagenzien bereitgestellt, um insgesamt 50 Zellsuspensionen zu verarbeiten, darunter 5 ml Positiv- und 5 ml Negativkontrolle-Zellsuspensionen mit ca. 1 x 10⁶ Zellen pro ml in 70 % (V/V) Ethanol.

Berichtete Anwendung
Immunzytochemie, durchflusszytometrische Analyse