GeneArt™ High-Order Genetic Assembly Systems, with yeast growth media

Das GeneArt® High-Order Gen-Assemblierungssystem ist ein hocheffizientes Kit für die gleichzeitige und nahtlose Zusammenstellung in jeden Vektor von bis zu 10 DNA-Fragmenten, die sich auf eine Länge von bis zu 110 kbp summieren. Das System beruht auf der Fähigkeit der Hefe, DNA-Fragmente mit hoher Effizienz aufzunehmen und zu rekombinieren. Dadurch wird die In-vitro-Behandlung von DNA erheblich reduziert, und es sind keine enzymatischen Behandlungen wie Restriktionen und Ligationen mehr erforderlich, während gleichzeitig präzise Fusionen von DNA-Sequenzen möglich sind. Das Kit enthält Materialien für die Umwandlung und Reinigung von Hefe, mit Hefeselektivmedien und für die Plasmid-Amplifikation brauchbarer Klone kompetentem E. coli.

• Einfach und leistungsstark — Klonen Sie bis zu 10 DNA-Fragmenten, mit der Sequenz Ihrer Wahl, gleichzeitig in einem einzigen Vektor (bis zu 110 kbp); keine Stellen für Restriktionsverdau, Ligation oder Rekombination erforderlich
• Präzision und Effizienz —Mit diesem Produkt können Sie genau das klonen, was Sie wollen, wo Sie wollen, und das in der gewünschten Ausrichtung mit einer Ausbeute von bis zu 90 % korrekter Klone, ohne dass zusätzliche Sequenzen übrig bleiben
• Flexibilität — Verwenden Sie unseren linearen Vektor, einen Vektor Ihrer Wahl, oder klonen Sie bereits vorhandene DNA-Fragmente ohne Endhomologie und ohne weitere Modifikationen
• Kostenfreie Tools — Entwerfen Sie DNA-Oligos und mehr mit unserer kostenlosen webbasierten Schnittstelle, die Sie Schritt für Schritt durch Ihr Projekt führt
• Diverse Anwendungen — Straffen Sie zahlreiche synthetische Biologie- und Molekularbiologietechniken durch schnelles Kombinieren, Hinzufügen, Löschen oder Austauschen von DNA-Segmenten

Für das Klonen von 1 bis 4 DNA-Fragmenten begrenzter Größe. Wenn Sie einen In-vitro-Ansatz bevorzugen, sollten Sie das GeneArt® Kit für die nahtlose Klonierung und Assemblierung (Kat.-Nr. A13288) in Betracht ziehen.

Einfache Erstellung neuer spezifischer Konstrukte aus verschiedenen DNA-Fragmenten
Das GeneArt® High-Order Genetic Assembly System nutzt die transformationsassoziierte Rekombination (TAR) in der Hefe Saccharomyces cerevisae, um bereits vorhandene DNA-Fragmente oder chemisch synthetisierte Oligonukleotide zu einem einzigen rekombinanten Molekül zu verbinden. DNA-Fragmente und der linearisierte Vektor werden basierend auf gemeinsamer endterminaler Homologie verbunden. Wenn zwischen den Stücken keine solche Endhomologie existiert, können sie mit Rekombinationslinkern, synthetischen DNA-Oligonukleotiden, zusammengefügt werden, die eine endterminale Homologie zwischen zwei nicht verwandten DNA-Fragmenten liefern. Der Prozess ist sehr effizient und nahtlos und hinterlässt nach der Zusammenstellung keine zusätzlichen Sequenzen. Obwohl es erwiesenermaßen für bis zu 0,5 Mb und 50 DNA-Fragmente funktioniert, wurde dieses Produkt für bis zu 110 kb und 10 DNA-Fragmente in einem Vektor optimiert.

Einfache Klonverifizierung
Um die Arbeit mit Hefe zu minimieren, werden rekombinante Hefeklone einem vereinfachten 10-minütigen DNA-Extraktionsprotokoll unterzogen. Die Extraktion liefert das zusammengesetzte Molekül in ausreichender Menge, um die Kolonie-PCR-Verifizierung der Verbindungen durchzuführen, sowie die direkte Transformation von E.coli-Zellen für die nachfolgende Analyse. Der firmeneigene Lysepuffer und die für die Extraktion benötigten Glasperlen sind im Kit enthalten.

Überlegungen zur Auswahl eines Klonvektors
Das GeneArt® High-Order Genetic Assembly System benötigt Shuttle-Vektoren, die eine hohe Kapazität haben und mit Hefe und E.coli (d. h. BAC-YAC Shuttle-Vektoren) kompatibel sind. Dieses Produkt enthält keinen Klonierungsvektor, aber wir bieten einen gebrauchsfertigen linearen Klonierungsvektor, der als separates Produkt GeneArt® pYES1L Vector mit Sapphire Technology™ (Kat.-Nr. AA13287) genannt wird. Sie können auch Ihren eigenen Vektor verwenden, aber er muss mit dem High-Order Gen-Assemblierungssystem kompatibel sein. Diese Kompatibilität lässt sich mit unserer GeneArt® Kassette für die Vektorkonvertierung hoher Ordnung (Kat.-Nr.A13291) problemlos erreichen.

Klonierungseffizienz
Bei der GeneArt® Assemblierung hoher Ordnung sind die Größe der DNA-Elemente, die Anzahl der Elemente ohne Endhomologie, die Gesamtgröße des Endmoleküls sowie die Qualität und Spezifität des Fragments die Hauptfaktoren, die die Klonierungseffizienz beeinflussen. Das terminale Ende der PCR-Fragmente (A-Überhänge oder Stumpf) hat keinen Einfluss auf die Klonierungseffizienz.

Typische Klonierungswirkungsgrade für unterschiedliche Fragmentmengen mit Endhomologie, die mit der Sapphire Technology™ in den GeneArt® pYES1L Vector integriert werden, sind:
• > 90 % für 5 DNA-Fragmente von je 10 Kb
• > 90 % für 10 DNA-Fragmente von je 5 Kb
• > 50 % für 10 DNA-Fragmente von je 10 Kb

Gemeinsame Klonierungseffizienz für bereits vorhandene Fragmente, ohne Endhomologie, die in den GeneArt® pYES1L-Vektor mit Sapphire Technology™ anhand „Stitching“-DNA-Oligonukleotiden zusammengefügt wird:
• > 90 % für 1 Fragment von 10 Kb
• > 75 % für 2 DNA-Fragmente von je 10 Kb

Erstellung von In-silico-Klonierungen
Ein wichtiger Schritt in der GeneArt® Genassemblierung hoher Ordnung ist das richtige Design von Fragmenten und Oligos mit der entsprechenden Homologie und den Abständen, die eine erfolgreiche Assemblierung Ihres Klons sicherstellen. Zur Vereinfachung und Beschleunigung des Designprozesses bieten wir ein kostenloses Online-Design-Hilfsmittel für die Planung Ihres In-silico-Experiments. Das Tool prüft die Kompatibilität des experimentellen Designs mit den Produktspezifikationen, entwirft DNA-Oligos für die PCR-Amplifikation oder für das Zusammenfügen der verschiedenen zu klonenden Elemente. Außerdem präsentiert es dem Benutzer eine grafische Darstellung des Vektors sowie eine herunterladbare kommentierte Sequenz im GenBank Format, die mit der Vector NTI® Software kompatibel ist.

Anwendungen
Das GeneArt® High-Order Genetic Assembly System wurde entwickelt, um Klonierungs- und DNA-Assemblierungsexperimente in zahlreichen Anwendungen in der Molekularbiologie und synthetischen Biologie zu ermöglichen. Das Produkt ermöglicht die Erstellung von modularen Expressionsvektoren mit austauschbaren Teilen und kann für die Ausführung einer Vielzahl verschiedener Aufgaben verwendet werden, die sonst mehrere Schritte umfassen. Das Kit eignet sich für die problemlose Bildung von Fusionsproteinen, die Entfernung, den Austausch oder das Hinzufügen von DNA-Elementen wie Restriktionsstellen, die Klonierung großer bereits vorhandener DNA-Fragmente ohne Endhomologie sowie für viele andere Techniken, die eine Manipulation der genetischen Sequenzen erfordern.