Das Thermo Scientific aLICator™ LIC-Klonierungs- und Expressionssystem ist für schnelles und effizientes, Ligations-unabhängiges Klonen und eine strenge Regulierung der Genexpression in E. coli konzipiert. pLATE Expressionsvektoren für Bakterien sind für eine hochkonzentrierte Expression der Zielproteine in Kombination mit einer minimalen Hintergrundexpression (nicht induziert) ausgelegt, was die Expression von Proteinen ermöglicht, die für E. coli-Zellen toxisch sind. Um den Prozess des Insert-Klonens in den Expressionsvektor zu rationalisieren und zu erleichtern, verwendet das aLICator-System eine direktionale LIC-Klonierungstechnologie, ein schnelles Verfahren, das eine hohe Klonierungseffizienz bietet.

Die streng regulierte Expression und das schnelle, effiziente, direktionale Klonen machen das aLICator LIC Klonierungs- und Expressionssystem zur besten Wahl für routinemäßiges und toxisches Genklonieren und Expression in E. coli.

Highlights

• Hocheffiziente LIC-Klonierung
• Enge Kontrolle der Genexpression
• Expression mit hoher Ausbeute
•Vielseitig — Expression von markierten oder unmarkierten Proteinen mit Entfernungsoption für Markierungen

Anwendungen

• Direktive PCR-Produkt Klonierung
• Eng regulierte Proteinexpression
• Expression von toxischen Genen

Prinzip

Das aLICator LIC Klonierungssystem verwendet eine direktionale LIC-Klonierungstechnologie, um das Klonen in einen Expressionsvektor zu vereinfachen und zu optimieren. LIC gewährleistet eine hohe Klonierungseffizienz von über 95 % und macht Ligations- und Restriktionsenzymverdauschritte überflüssig.

Die LIC-Methode verwendet T4 DNA-Polymerase, um spezifische 14 bis 21 einsträngige Nukleotid-Überhänge an den pLATE-Vektoren und DNA-Einsätzen zu erzeugen. Die T4 DNA-Polymerase hat zwei enzymatische Aktivitäten: 5'→3'-Polymeraseaktivität und 3'→5'-Exonukleaseaktivität. Die Exonuklease-Aktivität entfernt Nukleotide an den 3'-Enden der DNA, während die Polymerase-Aktivität die Kette mithilfe von dNTPs und dem komplementären DNA-Strang als Vorlage wiederherstellt. Im LIC-Protokoll wird nur dGTP in die Reaktion aufgenommen, wodurch die 3'→5'-Exonuklease- und 5'→3'-Polymerase-Aktivitäten beim ersten Auftreten von Cytosin im Komplementärstrang ausgeglichen werden. Nach dem Annealing werden LIC-Vektor und Einsatz ohne Verwendung von T4-DNA-Ligase in kompetente E. coli-Zellen umgewandelt. Die kovalente Bindungsbildung an den Kreuzungen zwischen Vektor und Einsatz tritt innerhalb der Zelle auf, um ein kreisförmiges Plasmid zu erhalten.

Merkmale

Das System besteht aus vier Kits, die auf der pLATE-Serie bakterieller Expressionsvektoren basieren:

• aLICator™ LIC-Klonierungs- und Expressionskit 1 - pLATE11-Vektor, unmarkierte Proteinexpression.
• aLICator™ LIC-Klonierungs- und Expressionskit 2 (N-terminale His-Tag/EK)—pLATE51-Vektor, N-terminale His-Tag-Proteinexpression.
• aLICator™ LIC-Klonierungs- und Expressionskit 3 (C-terminales His-Tag)—pLATE31-Vektor, C-terminale His-Tag-Proteinexpression.
• aLICator™ LIC-Klonierungs- und Expressionskit 4 (N-terminale His-Tag/WQ)—pLATE52-Vektor, N-terminale His-Tag Proteinexpression, WELQut-Spaltung.
• aLICator™ LIC-Klonierungs- und Expressionsset 1 (All-in-One/EK)—pLATE11-, pLATE51- und pLATE31-Vektoren, Auswahl aus unmarkierter, N- oder C-terminaler His-Tag-Proteinexpression.
• aLICator™ LIC-Klonierungs- und Expressionsset 2 (All-in-One/WQ)—pLATE11-, pLATE51- und pLATE31-Vektoren, Auswahl aus unmarkierter, N- oder C-terminaler His-Tag-Proteinexpression, WELQut-Spaltung.

Für Proteine mit einer bekannten Präferenz für die N- oder C-terminale 6xHis-Tag-Position wird die Verwendung des entsprechenden N- oder C-terminalen Kits empfohlen. Wenn die Proteinstruktur und -merkmale nicht bekannt sind, wird empfohlen, in alle drei Vektoren zu klonen und den am besten kompatiblen Vektor für die weitere Forschung zu bestimmen.

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