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Invitrogen™

pENTR™/D-TOPO™ Klonierungskit mit One-Shot™ TOP10 chemisch kompetentem E. coli

Die pENTR™/D-TOPO™ Cloning Kits nutzen eine äußerst effiziente 5-minütige Klonierungsstrategie (“TOPO™ Cloning”) für die direktionale Klonierung eines stumpfendigen PCR-Produkts inWeitere Informationen
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KatalognummerMenge
K24002020 Reaktionen
Katalognummer K240020
Preis (EUR)
1.096,00
Each
Menge:
20 Reaktionen
Preis (EUR)
1.096,00
Each
Die pENTR™/D-TOPO™ Cloning Kits nutzen eine äußerst effiziente 5-minütige Klonierungsstrategie (“TOPO™ Cloning”) für die direktionale Klonierung eines stumpfendigen PCR-Produkts in einen Vektor zur Verabreichung in ein Gateway™ oder MultiSite Gateway™ System. Stumpfendige PCR-Produkte können direktional mit mehr als 90 %-iger Effizienz kloniert werden, ohne Ligase, Verfahren nach der PCR oder Restriktionsenzyme.

Das Kit enthält alles, was zum Klonen und Auswählen Ihres PCR-amplifizierten Gens von Interesse erforderlich ist:

• Gateway™ System-tauglich – schneller Transfer geklonter Gene zwischen mehreren Vektorsystemen
• Schnell und einfach – von der PCR bis zum Gateway™ Entry-Klon in nur 3 Schritten und nur ∼5 Minuten Bearbeitungszeit
• Effizient – erzielen Sie über 90 % Klone mit dem Insert in der richtigen Orientierung
• Bewährt – zuverlässige Leistung seit über 10 Jahren

Übersicht pENTR™ /D-TOPO™ Klonierungs-Kits

VEKTOR

pENTR™ /D-TOPO™ Vektor Direktionaler Klonierungsvektor zur Eingabe in das Gateway-System

KLONIERUNGSMETHODE

Direktionale TOPO™ Klonierung Topoisomerase-I-basierte, ∼5 Minuten lange direktionale Ligation stumpfendiger, mit Proofreading-Polymerase amplifizierter PCR-Produkte mit dem Vektor

KOMPETENTE ZELLEN

Zwei Optionen Wählen Sie zwischen Kits für hohe Effizienz oder schnell wachsenden kompetenten Zellen
Einfacher Zugriff auf das Gateway™ System
Für einen Zugang zum Gateway™ System machen Sie eine PCR-Amplifikation des zu untersuchenden Gens und fügen das Produkt direkt dem mitgelieferten Topoisomerase-geladenen pENTR™/D-TOPO™ Vektor hinzu. Danach müssen Sie 5 Minuten lang inkubieren und die mitgelieferten kompetenten E. coli-Zellen transformieren. Die daraus resultierenden Gateway™ Entry-attL-Klone sind nun für eine effiziente Rekombination mit den gewünschten Gateway™ Destinationsvektoren bereit.

Optimierter pENTR™/D-TOPO™ -Vektor
Der pENTR™/D-TOPO™ Vektor (Abbildung 1) umfasst M13- und T7-Primer-Sequenzierungsstellen und attL-Rekombinationsstellen um die PCR-Produkt-Insertionsstelle. Die Klone können deshalb problemlos in die Gateway™ Destination-attR-Vektoren Ihrer Wahl sequenzverifiziert und rekombiniert werden. Ein Kanamycin-Resistenz-Gen und ein pUC-Ursprung dienen der Selektion und hohen Kopiepropagation in E. coli.

Vereinfachte direktionale Klonierung
Bei der Technologie zur direktionalen TOPO™ Klonierung sind keine PCR-Aufreinigungen, Vektorvorbereitungen oder andere zeitintensive DNA-Manipulationsschritte erforderlich. Fügen Sie einfach Ihre PCR-Reaktion direkt dem mitgelieferten Topoisomerase-geladenen Vektor hinzu. Inkubieren Sie 5 Minuten lang, führen Sie die Transformation aus, und Sie erhalten bis zu 90 % direktional eingefügte Klone. Ein vierbasiger Überhang auf den Vektorpaaren mit einer vierbasigen Sequenz im Vorwärts-Primer in Ihrer PCR-Reaktion sorgt für Direktionalität zur Topoisomerase-Ligationsreaktion (Abbildung 2).

Die Leistungsfähigkeit der Gateway™ Rekombinations-Klonierungstechnologie
Die Gateway™ Rekombinations-Klonierungstechnologie umgeht die Einschränkungen der restriktionsbasierten Klonierung. Sie haben auf diese Weise Zugang zu praktisch jedem Expressionssystem dank einer einstündigen, bis 99 % effizienten und reversiblen Gateway™ Rekombinationsreaktion. Die Möglichkeit, dieselbe DNA-Sequenz zwischen verschiedenen Vektoren ohne Anwendung von Restriktionsenzymen, Ligase, Subklonierungsschritten, Screening von zahllosen Kolonien oder Resequenzierungen zu wechseln, hilft dabei, Zeit, Kosten und Aufwand zu sparen.

Führende Klonierungstechnologien
Wenn es um Klonierung geht, sind seit über zehn Jahren die TOPO™ Klonierungstechnologie und die Gateway™ Rekombinationsklonierung der zuverlässige Partner Tausender von Wissenschaftlern. Die schnelle, einfache und effiziente TOPO™-Klonierung und Gateway™-Rekombination ermöglicht ein schnelles Klonen und den anschließenden Transfer von Genen zwischen einer Vielzahl von Gateway™-Expressionsvektoren.

Kit-Optionen
Das pENTR™/D-TOPO™-Klonierungskit kann entweder mit TOP10-kompetenten Zellen zur Standardklonierung oder mit Mach1™-T1R-kompetenten Zellen für schnelles Wachstum erworben werden.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für therapeutische oder diagnostische Zwecke bei Menschen oder Tieren vorgesehen.
Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung bei diagnostischen Verfahren.
Specifications
KlonierungsmethodeDirektionales TOPO™
Anzahl Reaktionen20 reactions
ProduktlinieOne Shot
ProdukttypTOPO-Klonierungskit
Menge20 Reaktionen
VektorpENTR
Unit SizeEach
Inhalt und Lagerung
Das pENTR™⁄D-TOPO™ Cloning Kit enthält pENTR⁄D-TOPO™ Vektor, dNTPs, Salzlösung, steriles Wasser, universelle M13-Sequenzierprimer, chemische OneShot™ TOP10 E. coli, S.O.C.- Medium und ein pUC19 Kontrollplasmid. Lagerung kompetenter E. coli bei -80 °C. Alle anderen Komponenten bei –20 °C lagern.

Häufig gestellte Fragen (FAQ)

Your Gateway-adapted TOPO vectors are supplied with a control template and control primers. Can I obtain the sequence of the control template?

The sequence of the control template is proprietary.

I am using a Directional TOPO Cloning vector for cloning my PCR product. I have screened a bunch of colonies but they all contain my insert cloned in the reverse direction. How can I solve this problem?

Here are possible causes and suggestions:

- Incorrect PCR primer design: Make sure that the forward PCR primer contains the sequence, CACC, at the 5' end. The 4 nucleotides, CACC, base pair with the overhang sequence, GTGG, in the Directional TOPO vector.
- Reverse PCR primer is complementary to the GTGG overhang at the 5' end: Make sure that the reverse PCR primer does not contain the sequence, CACC, at the 5' end.
- Use a thermostable, proofreading polymerase such as Accuprime Pfx DNA Polymerase (Cat. No. 12344024) to produce blunt-end PCR products.

How large of a PCR product can I recombine with a pDONR vector via BP cloning? Does the same apply for TOPO-adapted Entry vectors?

There is no theoretical limit to insert size for a BP reaction with a pDONR vector. Maximum size tested in-house is 12 kb. TOPO vectors are more sensitive to insert size and 3-5 kb is the upper limit for decent cloning efficiency.

How should I clean up my attB-PCR product?

After generating your attB-PCR product, we recommend purifying it to remove PCR buffer, unincorporated dNTPs, attB primers, and any attB primer-dimers. Primers and primer-dimers can recombine efficiently with the Donor vector in the BP reaction and may increase background after transformation into E. coli, whereas leftover PCR buffer may inhibit the BP reaction. Standard PCR product purification protocols using phenol/chloroform extraction followed by ammonium acetate and ethanol or isopropanol precipitation are not recommended for purification of the attB-PCR product as these protocols generally have exclusion limits of less than 100 bp and do not efficiently remove large primer-dimer products. We recommend a PEG purification protocol (see page 17 of the Gateway Technology with Clonase II manual). If you use the above protocol and your attB-PCR product is still not suitably purified, you may further gel-purify the product. We recommend using the PureLink Quick Gel Extraction kit.

I'm getting low cloning efficiency with my directional TOPO cloning reaction. What should I do?

Here are suggestions to try to increase your cloning efficiency with dTOPO cloning:

- Ensure that the 5' primer has CACC and the 3' primer does not have sequence similarity to GTGG.
- The molar ratio of PCR product: TOPO vector used is critical to success.

We recommend using a 1:1 to 2:1 molar ratio, starting with a 1:1 of PCR product: TOPO vector. The TOPO cloning efficiency decreases significantly if the ratio of PCR product: TOPO vector is <0.1:1 or >5:1. These results are generally obtained if too little PCR product is used (i.e., PCR product is too dilute) or if too much PCR product is used in the TOPO cloning reaction. If the yield of the PCR product has been quantitated, the concentration of the PCR product may need to be adjusted before proceeding to TOPO cloning. For pENTR TOPO vectors, using 1-5 ng of a 1 kb PCR product or 5-10 ng of a 2 kb PCR product in a TOPO cloning reaction generally results in a suitable number of colonies.

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Zitierungen und Referenzen (9)

Zitierungen und Referenzen
Abstract
A novel type of deubiquitinating enzyme.
Authors:Evans PC, Smith TS, Lai MJ, Williams MG, Burke DF, Heyninck K, Kreike MM, Beyaert R, Blundell TL, Kilshaw PJ,
Journal:J Biol Chem
PubMed ID:12682062
A previous report from this laboratory described two novel proteins that have sequence similarity to A20, a negative regulator of NF-kappaB (Evans, P. C., Taylor, E. R., Coadwell, J., Heyninck, K., Beyaert, R., and Kilshaw, P. J. (2001) Biochem. J. 357, 617-623). One of these molecules, cellular zinc finger anti-NF-kappaB ... More
West Nile virus discriminates between DC-SIGN and DC-SIGNR for cellular attachment and infection.
Authors:Davis CW, Nguyen HY, Hanna SL, Sánchez MD, Doms RW, Pierson TC,
Journal:J Virol
PubMed ID:16415006
'The C-type lectins DC-SIGN and DC-SIGNR bind mannose-rich glycans with high affinity. In vitro, cells expressing these attachment factors efficiently capture, and are infected by, a diverse array of appropriately glycosylated pathogens, including dengue virus. In this study, we investigated whether these lectins could enhance cellular infection by West Nile ... More
Identification of an antiangiogenic FGF2-binding site in the N terminus of the soluble pattern recognition receptor PTX3.
Authors:Camozzi M, Rusnati M, Bugatti A, Bottazzi B, Mantovani A, Bastone A, Inforzato A, Vincenti S, Bracci L, Mastroianni D, Presta M,
Journal:J Biol Chem
PubMed ID:16769728
'Long-pentraxin 3 (PTX3) is a soluble pattern recognition receptor with non-redundant functions in inflammation and innate immunity. PTX3 comprises a pentraxin-like C-terminal domain involved in complement activation via C1q interaction and an N-terminal extension with unknown functions. PTX3 binds fibroblast growth factor-2 (FGF2), inhibiting its pro-angiogenic and pro-restenotic activity. Here, ... More
The plant-specific kinase CDKF;1 is involved in activating phosphorylation of cyclin-dependent kinase-activating kinases in Arabidopsis.
Authors:Shimotohno A, Umeda-Hara C, Bisova K, Uchimiya H, Umeda M,
Journal:Plant Cell
PubMed ID:15486101
Cyclin-dependent kinases (CDKs) play essential roles in coordinate control of cell cycle progression. Activation of CDKs requires interaction with specific cyclin partners and phosphorylation of their T-loops by CDK-activating kinases (CAKs). The Arabidopsis thaliana genome encodes four potential CAKs. CAK2At (CDKD;3) and CAK4At (CDKD;2) are closely related to the vertebrate ... More
Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis.
Authors:Kobae Y, Uemura T, Sato MH, Ohnishi M, Mimura T, Nakagawa T, Maeshima M,
Journal:Plant Cell Physiol
PubMed ID:15653794
Cation diffusion facilitator (CDF) proteins belong to a family of heavy metal efflux transporters that might play an essential role in homeostasis and tolerance to metal ions. We investigated the subcellular localization of Arabidopsis thaliana AtMTP1, a member of the CDF family, and its physiological role in the tolerance to ... More
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