pENTR™/SD/D-TOPO™ Cloning Kit, with One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli

Die pENTR™/SD/D-TOPO™ Cloning Kits nutzen eine äußerst effiziente 5-minütige Klonierungsstrategie (“TOPO™ Cloning”) für die direktionale Klonierung eines stumpfendigen PCR-Produkts in einen Vektor zur Verabreichung in ein Gateway™ oder MultiSite Gateway™ System. Stumpfendige PCR-Produkte klonen bei einer Effizienz von über 90 % direktional in pENTR™/SD/D-TOPO™ Entry-Vektoren und enthalten eine vorgeschaltete Shine-Dalgarno-Sequenz zur Expression in Prokaryoten.

Das Kit enthält alles, was zum Klonen und Auswählen Ihres PCR-amplifizierten Gens von Interesse erforderlich ist:

• Gateway™ System-tauglich – schneller Transfer geklonter Gene zwischen mehreren Vektorsystemen
• Schnell und einfach – von der PCR bis zum Gateway™ Entry-Klon in nur 3 Schritten und nur 5 Minuten Bearbeitungszeit
• Effizient – erzielen Sie über 90 % Klone mit dem Insert in der richtigen Orientierung
• Bewährt – zuverlässige Leistung seit über 10 Jahren

Übersicht über pENTR™SD/D-TOPO™ Klonierungs-Kits

VEKTOR	pENTR™/SD/D-TOPO™ Vektor	Direktionaler Klonierungsvektor für die Eingabe in das Gateway™ System mit Optimierung für die prokaryotische Expression
KLONIERUNGSMETHODE	Direktionale TOPO™ Klonierung	Topoisomerase-I-basierte, ∼5 Minuten lange direktionale Ligation stumpfendiger, mit Proofreading-Polymerase amplifizierter PCR-Produkte mit dem Vektor
KOMPETENTE ZELLEN	Zwei Optionen	Wählen Sie zwischen Kits für hohe Effizienz oder schnell wachsenden kompetenten Zellen

Einfacher Zugriff auf das Gateway™ System
Für einen Zugang zum Gateway™ System machen Sie eine PCR-Amplifikation des zu untersuchenden Gens und fügen das Produkt direkt dem mitgelieferten Topoisomerase-geladenen pENTR™/SD/D-TOPO™ Vektor hinzu. Danach müssen Sie 5 Minuten lang inkubieren und die mitgelieferten kompetenten E. coli-Zellen transformieren. Die daraus resultierenden Gateway™ Entry-attL-Klone sind nun für eine effiziente Rekombination mit den gewünschten Gateway™ Zielvektoren bereit.

Optimierter pENTR™/SD/D-TOPO™ Vektor
Der pENTR™/SD/D-TOPO™ Vektor (Abb. 1) enthält einen T7-Gen-10-translationalen Enhancer und eine Ribosombindungsstelle (RBS) für eine optimale Expression von nativem Protein nach der Rekombination mit einem prokaryotischen Gateway™ Zielvektor. Sie können den Vektor auch zur Expression in anderen Wirtssystemen durch Rekombination mit verschiedenen Zielvektoren verwenden. Der Vektor hat M13- und T7-Primer-Sequenzierungsstellen und attL-Rekombinationsstellen, die die PCR-Produkt-Insertionsstelle flankieren. Die Klone können deshalb problemlos in die Gateway™ Destination-attR-Vektoren Ihrer Wahl sequenzverifiziert und rekombiniert werden. Ein Kanamycin-Resistenz-Gen und ein pUC-Ursprung dienen der Selektion und hohen Kopiepropagation in E. coli.

Vereinfachte direktionale Klonierung
Bei der Technologie zur direktionalen TOPO™ Klonierung sind keine PCR-Aufreinigungen, Vektorvorbereitungen oder andere zeitintensive DNA-Manipulationsschritte erforderlich. Fügen Sie einfach Ihre PCR-Reaktion direkt dem mitgelieferten Topoisomerase-geladenen Vektor hinzu. Inkubieren Sie 5 Minuten lang, führen Sie die Transformation aus, und Sie erhalten bis zu 90 % direktional eingefügte Klone. Ein vierbasiger Überhang auf den Vektorpaaren mit einer vierbasigen Sequenz im Vorwärts-Primer in Ihrer PCR-Reaktion sorgt für Direktionalität zur Topoisomerase-Ligationsreaktion (Abbildung 2).

Die Leistungsfähigkeit der Gateway™ Rekombinations-Klonierungstechnologie
Die Gateway™ Rekombinations-Klonierungstechnologie umgeht die Einschränkungen der restriktionsbasierten Klonierung. Sie haben auf diese Weise Zugang zu praktisch jedem Expressionssystem dank einer einstündigen, bis 99 % effizienten und reversiblen Gateway™ Rekombinationsreaktion. Die Möglichkeit, dieselbe DNA-Sequenz zwischen verschiedenen Vektoren ohne Anwendung von Restriktionsenzymen, Ligase, Subklonierungsschritten, Screening von zahllosen Kolonien oder Resequenzierungen zu wechseln, hilft dabei, Zeit, Kosten und Aufwand zu sparen.

Führende Klonierungstechnologien
Wenn es um Klonierung geht, sind seit über zehn Jahren die TOPO™ Klonierungstechnologie und die Gateway™ Rekombinationsklonierung der zuverlässige Partner Tausender von Wissenschaftlern. Die schnelle, einfache und effiziente Rekombination der TOPO™-Klonierung und Gateway™-Rekombination ermöglicht ein schnelles Klonen und dem anschließenden Transfer von Genen zwischen einer Vielzahl von Gateway™-Expressionsvektoren.

Kit-Optionen
Das pENTR™/SD/D-TOPO™-Klonierungskit kann entweder mit TOP10-kompetenten Zellen zur Standardklonierung oder mit Mach1™-T1R-kompetenten Zellen für schnelles Wachstum erworben werden.