BACE1 (β-Secretase) FRET Assay Kit, red

BACE1 (β-Secretase) ist ein Schlüsselenzym, das an der Produktion von Beta-Amyloid-Peptiden (Abeta) beteiligt ist, die in extrazellulären Amyloid-Plaques der Alzheimer-Krankheit (AD) gefunden werden. In einigen Fällen kann die früh einsetzende erbliche AD auf eine “schwedische” Mutation im Amyloid-Vorläuferprotein (APP) zurückgeführt werden, die die Spaltung dieses Proteins durch BACE1 dramatisch erhöht. Dieser und andere genetische und pathologische Belege haben zu therapeutischen Ansätzen geführt, die sich auf die Hemmung von BACE1 und anderen APP-spaltenden Enzymen, wie Gamma-Secretase, konzentrieren. Das BACE1-Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET)-Assay-Kit liefert eine empfindliche und effiziente Methode zum Screening potenzieller BACE1-Inhibitoren. Dieses Kit nutzt aufgereinigtes Baculovirus-exprimiertes BACE1 und ein neuartiges rotes FRET-Peptidsubstrat auf Basis der “schwedischen” Mutante.

Das BACE1 FRET-Assay-Kit bietet:

• Rote Emission zur Reduzierung von Interferenzstörungen
• Anregung bei 545 nm und Lese-Emission bei 585 nm
• Ein anwenderfreundlicher, schneller und homogener Assay, der in Lösung durchgeführt wird
• Vielseitige Formatierung für das High-Throughput-Screening
• Stabile Ergebnisse—Die Messungen können bis zu 24 Stunden lang durchgeführt werden

Das Prinzip des BACE1 FRET-Assays ist: Das Peptidsubstrat wird mit zwei Fluorophoren, einem fluoreszierenden Donor (einem Rhodamin (Rh)-Derivat) und einem firmeneigenen quenchenden Akzeptor synthetisiert. Der Abstand zwischen diesen beiden Gruppen wurde so gewählt, dass bei Lichterregung die Donor(D)-Fluoreszenzenergie aufgrund eines quantenmechanischen Phänomens, das als Resonanzenergietransfer bezeichnet wird, durch den Akzeptor (A) signifikant gequencht wird (Abbildung 1). Nach Spaltung durch die Protease wird das Fluorophor von der quenchenden Gruppe getrennt und dadurch die volle Fluoreszenzausbeute des Donors wiederhergestellt. So wird ein schwach fluoreszierendes Peptidsubstrat bei enzymatischer Spaltung stark fluoreszierend; der Anstieg der Fluoreszenz hängt linear mit der Rate der Proteolyse zusammen.

Quelle von BACE1 Enzym:
Eine cDNA-Sequenz, die die Aminosäuren 1 bis 460 des menschlichen BACE1 entsprechend der Ektodomäne kodiert, wurde in rekombinanten, mit Baculovirus infizierten Insektenzellen exprimiert. Aufgereinigtes BACE1 existiert als proBACE1-Form mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 55 kDa und der N-terminalen Sequenz TQHGIRLPLR.