Pierce™ RNA 3' End Desthiobiotinylation Kit

Le kit de desthiobiotinylation de l’extrémité 3’ d’ARN Thermo Scientific Pierce contient les réactifs nécessaires pour marquer efficacement et en toute facilité l’ARN avec de la desthiobiotine, en vue de leur utilisation comme sondes ou comme alternatives à l’utilisation d’anticorps pour l’enrichissement des protéines de liaison à l’ARN.

Caractéristiques du kit de desthiobiotinylation d’extrémité 3’ d’ARN :

• Non-radioactif : un marquage de biotine unique a une sensibilité de détection similaire à celle de la radioactivité
• Facile à utiliser : L’ARN ligase et le tampon de réaction optimisé sont inclus
• Économique : solution moins chère que l’achat de sondes ARN synthétiques biotinylées
• Marquage d’extrémité : impact minimal sur la structure secondaire de l’ARN
• Flexible : Le marquage par la desthiobiotine peut être utilisé pour la détection ou comme marqueur d’affinité pour la résine de streptavidine

Le kit de desthiobiotinylation de l’extrémité 3’ d’ARN Pierce est optimisé pour le marquage de l’extrémité 3’ d’ARN simple brin à l’aide de l’ARN ligase T4. Une fois marqué, l’ARN peut être utilisé comme sonde pour des expériences de retard sur gel (EMSA), de transfert Northern et d’interaction protéine-ARN. Les ARN marqués à la desthiobiotine peuvent également être utilisés pour l’enrichissement des protéines de liaison à l’ARN (RBP) à l’aide d’une résine d’affinité à la streptavidine, le marquage par desthiobiotine se liant à la streptavidine d’une matière permettant une élution douce du complexe ribonucléoprotéique. Le kit de marquage est également inclus dans le kit de pull-downs de complexes ARN-protéine magnétiques Thermo Scientific Pierce.

Comprend :
cytidine bisphosphate desthiobiotinylée, tampon et ligase d’ARN T4, oligonucléotide d’ARN non marqué à utiliser comme contrôle positif, étalon de sonde d’ARN biotinylé, inhibiteur de RNase, glycogène et réactifs d’amélioration de la ligature

Applications :
• Transfert Northern
• EMSA
• Enrichissement des protéines de liaison de l’ARN (RBP)

Ce kit de marquage de l’ARN utilise l’ARN ligase T4 pour lier la cytidine bisphosphate desthiobiotinylée à l’extrémité 3’ d’ARN simple brin. Chaque réaction de marquage est conçue pour 50 pmol d’ARN, mais d’autres quantités d’ARN peuvent être utilisées si besoin (la réaction a été testée de 1 pmol à 1 nmol d’ARN). La réaction s’effectue en présence de 20 fois plus de nucléotides desthiobiotinylés et nécessite un temps d’incubation allant de 30 minutes à 37°C (pour les ARN les moins complexes) à toute une nuit entre 4 et 16°C (pour les ARN plus longs ou plus complexes). L’optimisation de l’efficacité du marquage pour les structures d’ARN complexes s’effectue par l’adaptation du rapport ARN/nucléotides, l’augmentation du temps d’incubation ou l’ajout de DMSO pour relâcher la structure de l’ARN. Après l’extraction organique et la précipitation à l’éthanol, l’ARN marqué à la desthiobiotine est prêt à être utilisé dans les applications en aval.

Des exemples d’expériences avec différentes molécules d’ARN démontrent la robustesse de la réaction de ligature. L’ARN synthétique et l’ARN transcrit in vitro ont été évalués, et l’efficacité des ligatures a été déterminée par transfert en point semi-quantitatif avec un ARN biotinylé synthétique comme contrôle marqué à 100 %(tableau). Les efficacités des ligatures étaient toutes supérieures à 50 % et dépassaient souvent les 70 %. L’efficacité obtenue avec l’ARN contrôle du kit étant supérieure à 90 %, celui-ci est utilisé comme indicateur de l’adéquation des conditions générales de la réaction et de l’intégrité des réactifs. Une optimisation supplémentaire était nécessaire pour l’ARN présentant une structure secondaire significative et un repliement était nécessaire pour l’ARN transcrit in vitro après ligature.

Un dosage par pull-down impliquant l’interaction let-7 miRNA:Lin28 démontre la fonctionnalité expérimentale de l’ARN marqué à la desthiobiotine. La protéine Lin28, une protéine régulée au cours du développement, est un inhibiteur spécifique de la maturation du miARN let-7, qui agit en se liant au niveau d’une boucle du prémiARN let-7. Pour tester cette interaction, l’extrémité de la partie du miARN let-7 correspondant à cette boucle a été marquée avec de la cytidine desthiobiotinylée puis fixée à de la streptavidine couplée à des microbilles magnétiques. Les microbilles ont ensuite été incubées avec un lysat de cellules de carcinome embryonnaire (NCCIT) dans du tampon de liaison protéine-ARN. Après élution, les échantillons ont été analysés par western blot. Les résultats indiquent que le miARN let-7 marqué a spécifiquement enrichi la protéine Lin28 à partir du lysat de cellules de carcinome embryonnaire (NCCIT), contrairement à un ARN non apparenté.

Ce kit est également inclus dans le kit d’extraction magnétique des ARN-protéines Pierce et utilise le kit de marquage associé à des tampons de liaison, de lavage et d’élution optimisés pour enrichir les protéines de liaison d’ARN.