Pierce™ Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit

Le kit d’extraction magnétique de complexes ARN-protéine Pierce Thermo Scientific fournit aux chercheurs une méthode robuste et optimisée pour enrichir les interactions protéine-ARN en utilisant de l’ARN marqué à l’extrémité comme appât.

Caractéristiques du kit d’extraction magnétique de complexes ARN-protéine :

• Direct : capture des complexes ribonucléoprotéiques directement avec l’ARN marqué à son extrémité ; n’utilise pas et n’a pas besoin d’anticorps pour l’extraction
• Facile à utiliser : enrichissement des RBP sans godets de centrifugation ni aucune centrifugation ; procédure optimisée pour réduire au minimum le temps opérateur (moins de 3 heures) après la réaction de marquage de l’ARN
• Flexible : utilisez de l’ARN transcrit in vitro ou de l’ARN synthétique pour le marquage de longueurs et de complexité diverses ; protéines enrichies avec succès à l’aide de lysats traduits endogènes, surexprimés et in vitro
• Spécifique : faible bruit de fond dû aux microbilles ; l’ARN non apparenté ou muté n’enrichit pas de manière significative les RBP spécifiées
• Économique : solution moins chère que l’achat séparé d’ARN marqué à l’extrémité synthétique, de microbilles magnétiques et de réactifs
• Complet : contient un module de marquage et un module d’enrichissement avec les tampons nécessaires pour le dosage ; ARN de contrôle positif, ARN de contrôle négatif et anticorps anti-RBP inclus

Le kit d’extraction magnétique de complexes ARN-protéine comprend des réactifs pour enrichir efficacement des protéines de liaison d’ARN (RBP) avec de l’ARN marqué à son extrémité avec des microbilles magnétiques de desthiobiotine et de streptavidine. Le kit complet contient suffisamment de réactifs pour 20 réactions de marquage de l’ARN et 20 pull-downs de complexes ARN-protéine. Ce système d’enrichissement direct en complexes ARN-protéine constitue une alternative aux techniques de capture par anticorps de complexes protéine-ARN ou de groupes incorporés dans l’acide nucléique. Un autre avantage du kit est qu’il comprend des contrôles validés pour le marquage et le pull-down. Le kit se prête à plusieurs applications en aval, dont le transfert Western et la spectrométrie de masse (MS).

Comprend :
Kit complet comprenant le kit de desthiobiotinylation de l’extrémité 3’ de l’ARN Pierce, des contrôles ARN positif et négatif, des microbilles magnétiques de streptavidine compatibles avec les acides nucléiques et des tampons pour l’enrichissement et l’élution des RBP

Nécessite :
ARN et lysat fournis par l’utilisateur (échantillon expérimental)

Applications :
• Analyse mutationnelle
• Analyse des fonctions structurelles
• Identification des interactions ARN:protéines
• Analyse par MS de paires ou de complexes de liaison ARN:protéine inconnus

L’utilisation d’un ARN marqué comme appât pour l’enrichissement en protéines de liaison à l’ARN est plus avantageux qu’un enrichissement réalisé avec un anticorps, car cela permet de capturer directement l’interaction. Ce kit comprend le kit de desthiobiotinylation de l’extrémité 3’ de l’ARN Pierce qui utilise l’ARN ligase T4 pour fixer un seul nucléotide cytidine diphosphate aux extrémités 3’ de l’ARN simple brin. La desthiobiotine peut être utilisée pour la détection ou comme poignée d’affinité éluable. La longueur de l’espaceur entre le nucléotide et la desthiobiotine a été optimisée pour assurer une fixation efficace de la desthiobiotine aux microbilles sans compromettre l’accessibilité de l’ARN aux protéines.

La procédure d’enrichissement en protéines de liaison à l’ARN a été optimisée pour faciliter l’utilisation. L’ARN marqué est d’abord fixé sur les microbilles dans une orientation permettant la liaison des protéines à l’ARN. Les complexes ARN-microbilles sont ensuite équilibrés dans le tampon de liaison protéine-ARN avant d’ajouter le lysat protéique. Après lavage, les échantillons peuvent être élués avec le tampon d’élution de la biotine non dénaturant ou avec le tampon de charge SDS-PAGE. Les échantillons élués sont prêts pour une utilisation dans une variété d’applications en aval, notamment le transfert Western ou la spectrométrie de masse.

Le système de contrôle pour le dosage par extraction utilise l’ARN du récepteur des androgènes (RA) des séquences 3’ non traduites, l’ARN de la poly(A)25 et le lysat de cellules de mammifères. La séquence 3’ proximale non traduite (UTR) de l’ARN du récepteur des androgènes comprend des séquences riches en UC pour les protéines de liaison HuR et Poly(C) (CP1 et 2). Ces protéines de liaison à l’ARN régulent la stabilité des ARNm (HuR), ainsi que leur renouvellement et leur traduction (CP1 et 2). L’ARN poly(A)25 (ARN de contrôle négatif), ne contient aucun site de liaison aux protéines de liaison HuR ou poly(C).

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