L’Alexa Fluor™ 532 est un colorant brillant, jaune fluorescent, avec un niveau d’excitation parfaitement adapté à la ligne laser Nd:YAG à fréquence doublée. Utilisé pour une génération de signal stable en imagerie et en cytométrie de flux, le colorant Alexa Fluor™ 532 est hydrosoluble et insensible au pH de pH 4 à pH 10. En plus des formulations de colorants réactifs, nous proposons le colorant Alexa Fluor™ 532 conjugué à divers anticorps, peptides, protéines, traceurs et substrats d’amplification optimisés pour le marquage et la détection cellulaires (en savoir plus).

Le dérivé de maléimide Alexa Fluor™ 532 est l’outil le plus utilisé pour conjuguer le colorant à un groupe thiol sur une protéine, un oligonucléotide thiophosphate ou un ligand de faible poids moléculaire. Les conjugués Alexa Fluor™ 532 résultants présentent une fluorescence plus lumineuse et une photostabilité plus élevée que les conjugués d’autres fluorophores similaires sur le plan spectral.

Informations détaillées concernant le maléimide Alexa Fluor™ :

Marqueur fluorophore : colorant Alexa Fluor™ 532
Groupe réactif : maléimide
Réactivité : groupes thiol sur protéines et ligands, oligonucléotide thiophosphates
Ex / Em du conjugué : 528/552 nm
Coefficient d’extinction : 78 000 cm-1M-1
Poids moléculaire : 812,88

Réaction de conjugaison typique
La protéine doit être dissoute à une concentration de 50 à 100 µM dans un tampon approprié (10 à 100 mM phosphate, Tris ou HEPES), pH 7,0 à 7,5. Dans cette plage de pH, les groupes thiols de la protéine sont suffisamment nucléophiles pour réagir presque exclusivement avec le réactif en présence des groupes amines de la protéine, plus nombreux, qui sont protonés et relativement non réactifs. Nous recommandons de réduire tous les ponts disulfures à ce stade, en utilisant un agent réducteur en excès molaire (10X), comme DTT ou TCEP. L’excès de DTT doit être retiré par dialyse et la modification subséquente du groupe thiol doit être effectuée en l’absence d’oxygène pour prévenir la reformation des ponts disulfures ; ces précautions ne sont pas nécessaires lorsque le TCEP est utilisé avant la conjugaison du maléimide.

Le maléimide Alexa Fluor™ est généralement dissous dans du diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO) de haute qualité à une concentration de 1 à 10 mM immédiatement avant l’utilisation, et les solutions mères doivent être protégées de la lumière autant que possible. Généralement, cette solution de réserve est ajoutée à la solution de protéines au goutte à goutte, en agitant, pour produire environ 10 à 20 moles de réactif par mole de protéine ; la réaction se déroule à température ambiante pendant 2 heures ou à 4°C la nuit, à l’abri de la lumière. Tout réactif qui n’a pas réagi avec le groupe thiol peut être consommé en ajoutant un excès de glutathion, mercaptoéthanol, ou d’autres molécules solubles de faible poids moléculaire dotées d’une fonction thiol.

Purification de conjugué
Les anticorps marqués sont typiquement séparés du colorant Alexa Fluor™ libre à l’aide d’une colonne de filtration sur gel, comme la colonne Sephadex™ G-25, la colonne BioGel™ P-30 ou une colonne équivalente. Pour des protéines beaucoup plus grandes ou plus petites, sélectionnez un milieu de filtration sur gel ayant un seuil de poids moléculaire approprié ou purifiez par dialyse. Nous proposons plusieurs kits de purification optimisés pour différentes quantités de conjugués d’anticorps :
kit de purification de conjugués d’anticorps pour 0,5 à 1 mg (A33086)
kit de purification de conjugués d’anticorps pour 20 à 50 µg (A33087)
kit de purification de conjugués d’anticorps pour 50 à 100 µg (A33088)

En savoir plus sur le marquage des protéines et des anticorps
Nous offrons une large sélection de kits de marquage d’anticorps et de protéines de Molecular Probes™ pour convenir à votre produit de départ et à votre configuration expérimentale. Consultez nos kits de marquage d’anticorps ou utilisez notre outil de sélection de chimie de marquage pour d’autres choix. Pour en savoir plus sur nos kits de marquage, lisez Kits de marquage des protéines et des acides nucléiques, section 1.2 dans le manuel Molecular Probes™.

Nous vous préparerons un conjugué sur mesure
Si vous ne trouvez pas ce que vous cherchez dans notre catalogue en ligne, nous vous préparerons un conjugué d’anticorps ou de protéines sur mesure. Notre service de conjugaison personnalisé est efficace et confidentiel, et nous croyons en la qualité de notre travail. Nous sommes certifiés ISO 9001:2000.