ARNm de nucléase GeneArt™ CRISPR

L’ARNm de nucléase GeneArt™ CRISPR est formulée à l’aide d’un nouveau procédé de fabrication qui permet d’obtenir une qualité supérieure et des performances de produit améliorées. Cet ARNm de type sauvage Cas9 possède deux signaux de localisation nucléaire (NLSs). Les constructions Cas9 avec deux NLS ont été montrées plus efficaces pour cibler la protéine Cas9 vers le noyau (1). Le format d’ARNm est prêt à transfecter et permet de contourner les étapes de clonage chronophages requises grâce aux systèmes du vecteur CRISPR. L’ARNm Cas9 est co-transfecté avec un ARN guide (ARNg) spécifique à la cible qui dirige la protéine Cas9 vers le locus génomique prévu pour créer une rupture à double brin. Le format d’ARN complet offre une charge utile inférieure aux systèmes Cas9 plasmidiques pour améliorer l’administration dans la cellule et augmenter l’efficacité de la modification génomique. En outre, l’ARNm Cas9 peut servir dans les approches de multiplexage avec plusieurs ARNg. Utilisez cette approche pour déterminer quelle séquence d’ARNg fonctionne le mieux pour une cible particulière ou pour modifier plusieurs loci génomiques avec une seule transfection.

Comment obtenir une séquence d’ARNg
L’édition génomique avec la technologie CRISPR nécessite un ARN guide (ARNg) non codant afin de cliver l’ADN génomique à une séquence d’intérêt cible. L’ARNg comporte deux composants moléculaires : un ARN CRISPR (ARNcr) spécifique à la cible et un ARNcr transactivateur (ARNcrtra) qui ont été combinés en une seule transcription. La séquence cible (20 bases) doit être immédiatement en amont d’un motif PAM (NGG) qui permet au Cas9 d’initier la liaison. Le PAM ne se trouve que sur l’ADN cible et ne fait pas partie de la séquence CRISPR spécifique à la cible. L’ARNg et le motif PAM guident la nucléase Cas9 dans la séquence génomique cible pour former un complexe et créer une cassure à double brin d’ADN émoussé (DSB) trois nucléotides en amont du site PAM.

Utilisez notre outil de recherche et de conception GeneArt CRISPR pour rechercher dans notre base de données de >600 000 séquences d’ARNg spécifiques à chaque gène du génome de l’homme et de la souris. Les ARNg GeneArt préconçus sont optimisées pour l’extinction des gènes et pour cibler généralement les trois premiers exons transcrits pour chaque gène. Les résultats de recherche comprennent des recommandations basées sur la réduction des effets potentiels hors cible, des sites de liaison potentiels et des cartes exon avec des emplacements d’ARNg. Cet outil peut également être utilisé pour analyser n’importe quelle séquence d’intérêt pour concevoir des séquences CRISPR uniques.

Comment faire de l’ARNg
Une fois les séquences d’ARNg sélectionnées, choisissez parmi trois options pour la réalisation de l’ARNg :
1. Le kit de synthèse d’ARNg GeneArt Precision pour l’ARNg prêt pour la transfection en quatre heures, y compris l’assemblage de modèles.
2. Chaînes GeneArt CRISPR, un modèle d’ADN synthétique constitué de l’ARNg avec un promoteur T7 pour la transcription in vitro ou un promoteur U6 pour le format prêt à transfecter, qui peut être acheté via l’outil de recherche et de conception GeneArt CRISPR ou en remplissant le formulaire de commande d’ADN de chaînes GeneArt CRISPR et en le soumettant à GeneArtSupport@lifetech.com.
3. Économisez du temps et des efforts, et demandez à notre équipe de services personnalisés GeneArt de concevoir, synthétiser et purifier pour vous des séquences d’ARNg transcrites in vitro (IVT). Pour obtenir un devis ou passer une commande, veuillez communiquer avec notre département de services personnalisés au 1-800-955-6288 x45682 ou à l’adresse suivante : custom.services@lifetech.com.

Ressources
Protocole présenté : Ingénierie des cellules souches avec CRISPR-Cas9

Références
1.Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F. (2013) Ingénierie du génome multiplex au moyen des systèmes CRISPR / Cas. Science 339(6121):819-23.