Premo Autophagy Assays with Sensor LC3B, p62, or Tandem Sensor RFP-GFP-LC3B

Surveillez facilement les différentes étapes de l’autophagie cellulaire avec les dosages et les capteurs d’autophagie Premo, qui sont basés sur les chimères de protéines fluorescentes liant la LC3B ou la p62, ou le capteur en tandem RFP-GFP-LC3B. Les kits de dosage d’autophagie Premo offrent la sélectivité des capteurs d’autophagie Premo, qui sont basés sur des chimères de protéines associées à l’autophagie LC3B ou p62, et de protéines fluorescentes vertes (GFP) et/ou rouges (RFP), avec l’efficacité de transduction de la technologie BacMam. La transduction ou même la co-transduction peut être effectuée dans une grande variété de cellules, y compris les neurones et les cellules souches neurales (CSN) à l’aide d’un protocole simple qui implique l’ajout du réactif chimérique BacMam 2.0 aux cellules, en laissant incuber pendant la nuit, puis en visualisant la transduction à l’aide des paramètres standard GFP (protéine verte fluorescente) et/ou RFP (protéine rouge fluorescente).

Les capteurs d’autophagie Premo tirent parti des protéines associées à l’autophagie LC3B ou p62, ainsi que des GFP ou des RFP, pour détecter l’induction ou l’inhibition de l’autophagie dans les cellules. Les capteurs d’autophagie Premo sont transduits à l’aide de la technologie BacMam (insecte baculovirus avec un promoteur de mammifère), ce qui permet une visualisation sans ambiguïté des protéines chimériques dans les autophagosomes. Les réactifs BacMam ne se répliquent pas dans les cellules de mammifères et sont donc sûrs à manipuler. Ils sont également non cytotoxiques et prêts à l’emploi. Contrairement aux vecteurs d’expression typiques, les réactifs BacMam permettent une expression titrable et reproductible et offrent une efficacité de cotransduction élevée ; par conséquent, plusieurs réactifs BacMam peuvent être facilement utilisés dans les mêmes cellules. Des améliorations récentes apportées au système BacMam permettent une transduction efficace dans une plus grande variété de cellules, y compris les neurones et les cellules souches neurales (CSN) avec un protocole simple et en une étape. Pour visualiser l’autophagie, il vous suffit d’ajouter le capteur d’autophagie BacMam aux cellules et de laisser incuber pendant la nuit pour l’expression des protéines, puis de détecter le signal à l’aide de paramètres de fluorescence GFP et/ou RFP standard sur votre instrument.

La protéine LC3B joue un rôle essentiel dans l’autophagie. Normalement, cette protéine réside dans le cytosol, mais après clivage et lipidation avec la phosphatidyléthanolamine, la LC3B s’associe au phagophore. Cette localisation peut être utilisée comme marqueur général pour les membranes autophagiques. La protéine p62, également connue sous le nom de séquestosome (SQSTM1), est une protéine de liaison de l’ubitiquitine qui fonctionne comme un récepteur pour les cargos destinés à être dégradés par la machine autophagique cellulaire. Lorsque l’autophagie est induite, la protéine p62 se localise aux autophagosomes et est ensuite dégradée. Inversement, avec l’inhibition de l’autophagie, la protéine p62 s’accumule dans l’autophagosome. Ainsi, la localisation subcellulaire de la chimère protéique fluorescente p62 sert de marqueur utile pour l’induction et l’inhibition de l’autophagie.

En outre, en combinant la GFP sensible à l’acide (c.-à-d., la GFP émeraude) avec une RFP insensible à l’acide (c.-à-d., la TagRFP) dans le capteur en tandem RFP-GFP-LC3B, le changement d’un autophagosome (pH neutre) à l’autolysosome (avec un pH acide) peut être visualisé en imageant la perte spécifique de la fluorescence de la GFP lors de l’acidification de l’autophagosome suite à la fusion lysosomale. Lors de l’induction de l’autophagie, le capteur d’autophagie en tandem Premo marque les autophagosomes perforés ; ces structures sont positives pour les GFP et les RFP. Une fois le lysosome fusionné, le pH chute, ce qui absorbe les GFP, rendant les autolysosomes rouges. De plus, combiner le capteur en tandem d’autophagie Premo avec le rouge profond LysoTracker (disponible séparément) émettant dans le rouge lointain permet une analyse sur trois couleurs de la dynamique autophagosomale / autolysomale / lysosomale.

Chaque kit de dosage d’autophagie Premo comprend du diphosphate de chloroquine, qui est utilisé comme contrôle négatif pour inhiber l’autophagie.

Avantages de l’utilisation des dosages d’autophagie Premo
• Inspiré du multiplex — combiner le capteur en tandem d’autophagie Premo avec le rouge profond LysoTracker émettant dans le rouge lointain permet une analyse en trois couleurs de la dynamique de la voie autophagique complète
• Système de libération haute efficacité — transduction > 90 % d’un large éventail de lignées de cellules de mammifères, notamment des cellules primaires, des cellules souches et des neurones
• Rapide et pratique — ajoutez simplement le réactif d’autophagie Premo à vos cellules, laissez incuber pendant la nuit et imagez, ou stockez les cellules congelées et prêtes pour dosage pour utilisation ultérieure
• Robuste — les réactifs d’autophagie Premo sont non réplicatifs dans les cellules de mammifères, n’ont pas d’effet cytopathique observable et conviennent aux protocoles de niveau de sécurité (BSL) 1
• Configurations multiples : — les capteurs d’autophagie Premo sont disponibles dans les configurations chimériques suivantes :
P36235 : LC3B-GFP ; LC3B de contrôle (G120A)-GFP ; P36236 : LC3B-RFP ; LC3B de contrôle (G120A)-RFP ; P36239 : RFP-GFP-LC3B ; P36240 : GFP-p62 ; P36241 : RFP-p62