PCR初心者必見！ プライマーの設計で守るべき10のオキテ

1．18～30塩基の長さにする。

2．融解温度は55～65℃、プライマー同士の温度差を5℃以内にする。

3．プライマーのTm値が低い場合は、よくGC含有量が多い配列を探す、あるいはプライマーの長さを少し伸ばす。

4．GC含有率は40～60％とし、結合を促進するため3’末端はGまたはCにする。

5．通常は、効率よく切断するために、プライマーの制限酵素部位の5’末端に3～4塩基付加する。

6．プライマー内部の二次構造形成を避け、GCリッチ領域とATリッチ領域の分布のバランスがとれているようにする。

7．4塩基以上の連続した同一塩基配列や繰り返し配列を避ける。

8．プライマー内部での3塩基以上の相補的配列、またプライマー間（フォワードプライマーとリバースプライマー間）での相補的配列を避ける。

9．クローンニングに用いるプライマーの場合は、最低でもカートリッジ精製以上のグレードを推奨。

10．変異導入に用いるプライマーの場合は、プライマーの中央部にミスマッチの塩基が来るようにする。