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あっという間にシーケンス解析！ルーチン作業の時間短縮にBigDye™ Direct Cycle Sequencing Kit

Written by | Published: 06.10.2020

シーケンス解析をしていると、反応や精製の作業ステップが多く、毎回同じ試薬を使い、同じ作業、どこか省略できないのかと考えてしまうときはありませんか？でも、シーケンス反応って他に方法ないよね？と、半ば諦めの境地にいらっしゃる方も多いのでは？今回は、そんな皆さんに是非試して頂きたい、Applied Biosystems™ BigDye™ Direct Cycle Sequencing Kitをご紹介します。
▼こんな方におすすめです！
・シーケンスワークフローの時間短縮をしたい方
・同じ領域を繰り返しシーケンスしている方

PCR反応後のチューブに、試薬を添加していくだけ！PCR後の精製も不要！

従来のステップを改めて確認してみますと、

DNA抽出→目的領域をPCRで増幅→PCR後の精製→濃度確認→シーケンス反応→シーケンス反応後の精製→シーケンサーで泳動

と、チューブからまた別のチューブへと反応液を移し、試薬を添加して、という作業が続き、ほぼ丸一日かけての作業になります。

ここで今回お勧めしたいBigDye™ Direct Cycle Sequencing Kitの中身を見てみましょう。
・PCRマスターミックス
・シーケンシングマスターミックス
・シーケンス用プライマー（M13 Forward/Reverse）
なお、PCR用プライマーはご自身で用意いただくことになりますが、このキットさえれあれば、PCR反応～シーケンス反応まで賄えてしまう、というわけです。

ただし、ご準備いただくPCR用プライマーに、一つ注意点があります。
キットの内容を見ていただくとわかる通り、シーケンスプライマーはすでにM13 Forward／M13 Reverse と決まっています。そのため、PCR用プライマーには、Forward, Reverseともに5’末端にM13配列を付加したM13 tailed プライマーを準備し、PCRでM13の配列を含む断片を増幅させる必要があります。

では、早速BigDye™ Direct Cycle Sequencing Kitのワークフローを見ていきたいと思います。

①PCR反応（Forward,Reverse用に2チューブ準備）
・チューブに、DNAテンプレート、M13 tailed PCRプライマー（Forward,Reverse）、キットに含まれるPCRマスターミックスを添加し、サーマルサイクラーでPCR反応（～約90分）

②精製＋シーケンシング反応
・PCR反応が終了した2チューブに、それぞれキットに含まれる試薬とM13プライマーを添加
Forward用：シーケンスマスターミックス＋M13プライマー（Forward）
Reverse用：シーケンスマスターミックス＋M13プライマー（Reverse）

このまま、サーマルサイクラーにかけ、シーケンス反応開始です。既にお気づきかもしれませんが、PCR後の溶液を移し替える必要がないのです！そして、PCR反応後の精製も必要ありません。これはシーケンシングマスターミックスに、PCR後の精製試薬と、シーケンス反応用試薬が含まれているためです。試薬を添加して、サーマルサイクラーに置くだけで、PCR後の精製と、シーケンス反応が終了。すでに、ここまでで簡便さを感じてしまった方も多いのではと思いますが、次のシーケンス反応後の精製も簡便な試薬がありますので、併せてご紹介します。

さらにBigDye X Terminator Purification Kitとの組み合わせで、最後まで1チューブで反応可能

皆さんは、シーケンス反応後の精製をどのようにされていますでしょうか？
エタ沈、カラム精製などされている方も多いと思いますが、エタ沈ではペレットも一緒に捨ててしまった！なんて苦い経験はありませんか？
ここでは、そんなお悩みを一蹴する、Applied Biosystems™ BigDye XTerminator™ Purification Kitをご紹介したいと思います。

BigDye Direct Cycle Sequencing Kitでシーケンス反応まで行った後、この精製キットを使用すれば、PCR反応～シーケンサーに掛けるまで、なんと1チューブで完結してしまうのです！
BigDye X Terminaor Purification Kitは、
・SAM solution（バッファー）
・BigDye X Terminator（ビーズ)
で構成されています。

この2液をシーケンス反応後のチューブに添加、そのままミキサーで攪拌します。この時に、シーケンス反応に使用されなかった、余剰のDyeがビーズに吸着します。その後遠心で、余剰Dyeがビーズに吸着したままチューブの底に沈み、上清には目的の断片のみが存在する状態、となるわけです。
当社製品（SeqStuio, 3500/3500xl, 3130/3130xl, 3730/3730xl/3730xl-LV）を使用されている方はBigDye X Terminatorで精製したサンプル専用のランモジュールの用意がありますので、チューブの底にビーズが沈殿した状態で装置にセットしてもOKです。1チューブに試薬を添加するだけで、最後まで作業が終わってしまうのです！

同じ領域を繰り返しシーケンスしている方には非常にお勧め！

ここまで読んで頂いて、この試薬を早速使ってみようかな！と思ってくださった方もおられるかもしれません。ただ、この試薬を使用するには、PCRプライマーにM13の配列を付加して合成する必要がありますので、コストが少し上乗せされてしまいます。このため、さまざまな領域のシーケンスを考えている方は、その都度M13 tailedプライマーを設計しなくてはいけませんし、その分コストもかかってしまいます。
逆に、決まった領域のみを何度もシーケンスするような、ルーチン作業をされている方には、非常にマッチしていますので、作業の簡便化に貢献してくれること間違いなしです！

まとめ

・試薬を添加していくだけの簡便さ
・BigDye X Terminator Purification Kitとの組み合わせで、PCR反応からシーケンスランまで一つのチューブで完結
・同じ領域を繰り返しシーケンスする場合にはピッタリの試薬

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