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ダイレクトシーケンスをより素早く行う秘訣とは？

Written by | Published: 03.17.2020

シーケンシングは、遺伝子の機能解析ために目的のDNA領域をクローニングしたベクターや、ゲノム編集のために構築したベクターが、正しく構築されているかを確認するために利用されています。一方、複数サンプルの特定遺伝子を直接（ダイレクトに）PCRした後にシーケンスし、得られた塩基配列を比較することによって、疾患等に関連する変異の解析にも利用されています。このクローニングを介さずダイレクトにゲノム領域をシーケンスできる方法は、ダイレクトシーケンス法と呼ばれ、短時間で簡単に結果が得られる方法として広く用いられています。

本記事では、PCR産物のダイレクトシーケンスの概要から、PCRクリーンアップの三つの方法、さらには短時間でダイレクトシーケンスを行うための新規ソリューションをご紹介します。

▼こんな方におすすめです！
・ダイレクトシーケンスやPCRクリーンアップに興味がある方
・ダイレクトシーケンスをこれから行う人、または既に実施したことがある人
・なるべく短時間でターゲットシーケンスやPCRクリーンアップを実施したい方

 

そもそもダイレクトシーケンス法とは？

ダイレクトシーケンス法とは、大腸菌を用いたクローニングやプラスミド精製などのステップを介さず、PCR産物を直接鋳型として塩基配列を決定する方法です。

ゲノムの特定の領域を直接読むことができるため、ヘテロ変異や体細胞変異など遺伝子変異の探索に利用されます。クローニングに関わる時間やコストが不要であるため、素早く、かつ低コストで塩基配列を決定するのに効果的です。

シーケンス前処理の方法 プロセスにかかる時間
サブクローニング後にシーケンスする方法 3日から1週間

（最短でもプラスミド構築、精製に1日要します。その後シーケンスを行うので最短3日を要します。）
ダイレクトシーケンス法 抽出から解析まで1日で可能

 

 

ダイレクトシーケンスを素早く行うために

時間とコストを軽減できるダイレクトシーケンスですが、効率よく行うには下準備が必要です。それは、過剰なプライマーやヌクレオチドの除去です。PCR反応後のサンプル内に未反応のプライマーやヌクレオチドが過剰に含まれていると、酵素反応の妨げとなったり、バックグラウンドのシグナルが大きくなったりしてしまい、シーケンスの結果に悪影響を与えてしまうからです。したがって、このPCR産物のクリーンアップをいかに早く行うかが、ダイレクトシーケンスを短時間で実施する上での鍵となります。

また、当社ではM13の共通配列をPCRプライマーに付加し、ダイレクトシーケンスに最適化させた独自のPCRマスターミックスとシーケンス試薬をパッケージした『Applied Biosystems™ BigDye™ Direct Cycle Sequencing Kit』も販売しています。
このキットは、PCR クリーンアップのステップを排除することで効率的なワークフローを実現し、5´ 末端におけるシーケンスデータを改善します。また、BigDye を用いるダイレクト PCR シーケンスワークフローは 1 つのプレートで反応できるため、ステップ間のサンプルの移動が不要です。そのためハンズオン時間が短縮し、ピペット操作ミスが減り正確さが向上します。

『BigDye™ Direct Cycle Sequencing Kit』の商品詳細ページはこちら

Bigdye

 

 

 

 

 

さらにBigDye Xterminator精製キットを組み合わせると最初のPCR反応からランの実施まで1つのプレートで反応させることができるため、ステップ間のサンプルの移動が不要です。そのためハンズオン時間が短縮し、ピペット操作ミスが減り正確さが向上します。

『BigDye Xterminator精製キット』の商品詳細ページはこちらBigDye XTerminator

 

従来のPCRクリーンアップ法

ここからは、PCR産物のクリーンアップ法を3つ紹介します。

1. 磁気ビーズを利用する方法

磁性ビーズが核酸に結合する性質を利用。全部で9ステップあり、トータルで45分間を要します。

2. 酵素反応を利用する方法

プライマーやヌクレオチドを分解する酵素の性質を利用（ExoSAP-IT™ PCR Product Cleanup Reagent）。全2ステップでトータル30分間を要します。

3. スピンカラムを利用する方法

核酸がシリカゲルに結合する性質を利用。全8ステップありトータルで20分間を要します。

 

以上のように、これまで最短でもPCRクリーンアップ法は20分を要するとされてきました。

 

新製品！5分でできるPCRクリーンアップ法のご紹介

ExoSAP-IT Express 試薬を用いた、酵素によるPCR反応液のクリーンアップ

ExoSAP-IT Express 試薬を用いた、酵素によるPCR反応液のクリーンアップ

そこで、新たに登場したのがApplied Biosystems™ ExoSAP-IT™ Express試薬です。他のPCRクリーンアップとほぼ同等の精製クオリティやシグナル強度、シグナルノイズ比を保ちつつ、最短5分でのPCRクリーンアップを可能にしました。
これは主に、従来のエキソヌクレアーゼの改変型が開発のベースとなって、熱感受性が向上したことに起因します。また、多サンプルであっても1回のピペット操作で反応が完了でき、ハイスループットな実験が行えるのも大きな特長です。

より詳細が気になる方は下記ボタンをクリックしてご参照ください。

ExoSAP-IT™ Express試薬の詳細はこちらExoSAP-IT and ExoSAP-IT Express PCR Cleanup Reagents

まとめ

ExoSAP-IT Express 試薬とスピンカラムおよび磁気ビーズとの比較

ExoSAP-IT Express 試薬とスピンカラムおよび磁気ビーズとの比較
ExoSAP-IT Express 試薬に使用されている新しいテクノロジーによって、最小限のステップでサンプルのクリーンアップ時
間を大幅に短縮し、簡単なワークフローを実現します。

・ダイレクトシーケンスをより素早く行うには、PCRクリーンアップの効率化が鍵となる
・PCRクリーンアップには磁気ビーズや酵素反応、スピンカラムの利用などがある
・ExoSAP-ITを利用すれば、最短5分でPCRクリーンアップができる

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