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シーケンス解析のトラブルシュート：ノイズピークと二重ピーク

Written by | Published: 12.04.2024

シーケンス解析で、ノイズピークが検出されたり、ピークが二重になって検出されたりすると、該当領域の塩基配列を良好な精度で解読することができません。本ブログでは、このようなデータトラブルについて、予測される原因と対処をご紹介いたします。

スパイクノイズ

シーケンス解析データに、幅の狭いスパイクノイズが検出され、拡大すると4色全てのピークが見られる場合（図1）、気泡などの影響が考えられます。スパイクノイズが検出された場合の対処法は下表のとおりです。

図1. スパイクノイズが検出されたデータ例

図1. スパイクノイズが検出されたデータ例

予測される原因 対処法
気泡、結晶などが検出部を通過 ＜3500※1、SeqStudio Flex※2、3730xl LV※3システム＞

  • ポンプブロックを確認し気泡が発生している場合は除去する
  • ポンプブロックに気泡がないことを確認し、サンプルを再ランする

＜SeqStudioシステム※4＞

  • サンプルを再ランする

＜3730xl LVシステム＞

  • ポリマーボトルに結晶が存在する場合、ポリマーを交換する
ポリマー（SeqStudioシステムの場合はカートリッジ）が推奨の使用期限を超過していた
  • ポリマー（SeqStudioシステムの場合はカートリッジ）を交換する

決まった領域に赤と青の大きなノイズピーク

シーケンス解析データの決まった領域（70 bp、120 bp、200 bp付近）に、赤と青の大きなノイズピークが検出された経験はありますか？これは、蛍光標識ジデオキシヌクレオチド（ダイターミネーター）がキャピラリー中に取り込まれて検出されたピークで、Dye Blobピークと呼ばれます。シーケンス反応後の溶液中には、多くの場合、反応に使われなかったダイターミネーターが残存します。シーケンス反応後の精製で、これらの余剰のダイターミネーターを除去しきれなかった場合、Dye Blobピークが検出されます（図2）。

図2. Dye Blobピークが検出されたデータ例（Electropherogram）

図2. Dye Blobピークが検出されたデータ例（Electropherogram）

ダイターミネーターが精製で除去しきれない原因は、大きく分けて二つあります。一つは、シーケンス反応後の精製不良、もう一つは、シーケンス反応不良です。どちらか判別するためには、Raw Dataを確認します。Applied Biosystems™ Sequencing AnalysisソフトウエアでRaw Dataを確認する手順は、こちらをご参照ください。図3 （a）のように、Dye Blobピークとシーケンス反応産物のピークの両方が検出されている場合は精製不良、（b）のようにシーケンス反応産物のピークが小さい、あるいは、検出されていない場合はシーケンス反応不良と考えられます。

図3. Dye Blobピークが検出されたRaw Data例 （a）ではシーケンス反応産物のピークが検出されているが、（b）はほとんど見られない

図3. Dye Blobピークが検出されたRaw Data例
（a）ではシーケンス反応産物のピークが検出されているが、（b）はほとんど見られない


それぞれの原因に対する対処法は下表のとおりです。

予測される原因 対処法
シーケンス反応は進んでいるが、反応後の精製でダイターミネーターを除去できていない（図3 （a）） シーケンス反応産物の精製方法を変更；

  • エタノール沈殿により精製している場合は、Applied Biosystems™ BigDye XTerminator™ Purification Kitの使用を検討
BigDye XTerminator Purification Kitを使用している場合、シーケンス反応産物と試薬との混合が不十分
  • BigDye XTerminator Purification Kitのプロトコルに従って混合する
  • ミキサーでの混合条件（攪拌速度、時間）を見直す
  • プレート（チューブ）が確実にミキサーに固定されていることを確認する
BigDye XTerminator Purification Kit を使用している場合、Applied Biosystems™ XTerminator™ Solutionの添加量が少ない
  • XTerminator Solutionのボトルをよく攪拌してから分注する
  • 広径チップを使い、XTerminator Solution を分注する
シーケンス反応が進まず、多量のダイターミネータが残存している（図3 （b）） シーケンス反応が進まない要因を検証；

  • テンプレートDNAの品質確認、およびシーケンス反応液への添加量の最適化
  • シーケンスプライマーの品質確認（凍結融解が多い場合、ストックから再調製）
  • Applied Biosystems™ BigDye™ Terminator Ready Reaction Mixを希釈して使用している場合、標準プロトコルへ戻す
  • BigDye Terminator Ready Reaction Mixの凍結融解を繰り返している（目安：10回以上）場合は、新しい試薬を使用する
  • Applied Biosystems™ BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Kit付属のコントロールDNAとプライマーを用いてシーケンス反応を行い、反応不良の原因がテンプレートDNAまたはプライマーか、それ以外かを判別する

二重ピーク

シーケンス解析で得た波形が二重になる原因はさまざま考えられます。以下に、二重ピークとなったデータの状態に応じた原因と対処法をご紹介します。

シグナル強度が高すぎることによる二重ピーク

シーケンス解析で得られたElectropherogramで、メインピークの下に二次ピークが検出され、二重ピークとなっている場合、シグナル強度が高すぎるかもしれません。シグナル強度は、Sequencing AnalysisソフトウエアのRawタブやAnnotationタブから確認できます（確認方法はこちら）。
Rawタブで表示される「Raw Data」のピーク高は、ジェネティックアナライザで検出された蛍光シグナルの強度を示します（単位：RFU）。3500、SeqStudio Flex、SeqStudio、3730xl LVシステム、いずれのジェネティックアナライザも、検出できる蛍光シグナルの上限は32,000 RFUです。Raw Dataのピーク強度が32,000 RFUに近い、あるいは超えている場合は、シグナル強度が高すぎます。
Annotationタブに示される「Ave Signal Intensity」には、塩基ごとの平均シグナル強度が表示されます。この数値が10,000を超える場合、シグナル強度が高すぎると判断できます。

図4. シグナル強度が高すぎるシーケンス解析データの例

図4. シグナル強度が高すぎるシーケンス解析データの例

シグナル強度が高すぎることで二重ピークとなった場合の対処法は下表のとおりです。

予測される原因 対処法
シグナル強度が高すぎる ローディングするシーケンス産物の量を減らして再度ランする
＜ローディング量を減らす方法＞

  • サンプルをApplied Biosystems™ Hi-Di™ホルムアミドで希釈する
  • シーケンス反応に使用するテンプレートDNA量を減らす

シーケンスの開始時のみ二重ピーク

シーケンス開始時のみ二重ピークとなった場合（図5）、用いたプライマーのデザインに問題があるかもしれません。予測される原因と対処法を以下に示します。

図5. シーケンス開始時が二重ピークとなったデータ例

図5. シーケンス開始時が二重ピークとなったデータ例

予測される原因 対処法
シーケンス反応のテンプレートとしたPCR産物にプライマーダイマーが含まれていた
  • PCRプライマーを再設計し、プライマーダイマーが形成されるデザインを除外する
  • PCR産物の精製工程で、プライマーダイマーを除去する
シーケンス反応のテンプレートに、複数のプライマー結合領域がある
  • シーケンスプライマーの結合領域の相同性を再度確認する
  • 必要に応じてプライマーを再設計する

きれいなシーケンス後に二重ピーク

ダイレクトシーケンス法では、ゲノムDNAの解析したい領域をPCR増幅し、得られたPCR増幅産物を鋳型として塩基配列を決定します。シーケンス波形の途中から二重ピークとなる場合、解析領域に塩基の挿入や欠失が存在する可能性が考えられます。

図6. シーケンス波形の途中から二重ピークとなったデータ例

図6. シーケンス波形の途中から二重ピークとなったデータ例

予測される原因 対処法
解析領域に挿入／欠失がある
  • フォワード側およびリバース側のシーケンス解析データを取得し、変異解析用ソフトウエア※5を用いて、得られた塩基配列をアセンブルし、変異を調べる
  • ダイレクトシーケンス法でなく、サブクローニング法※6でシーケンス解析を行い、二重ピークが検出されないシーケンス解析データを取得する

※1　Applied Biosystems™ 3500／3500xLジェネティックアナライザ
※2　Applied Biosystems™ SeqStudio™ 8 Flex／24 Flexジェネティックアナライザ
※3　Applied Biosystems™ 3730xl DNAアナライザ （Latest Version）
※4　Applied Biosystems™ SeqStudio™ ジェネティックアナライザ
※5　Applied Biosystems™ Variant Reporter™ ソフトウエア、SeqScape™ ソフトウエア
※6 クローン化した配列をベクターに組み込み塩基配列を読む方法

まとめ

今回は、シーケンス解析データでみられるノイズピークと二重ピークについて、その原因と対処法をご紹介しました。シーケンス波形は得られているのに、ノイズピークや二重ピークによりデータのクオリティが下がってしまった場合は、本ブログの内容がトラブル解決のための一助となるかもしれません。

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