Thermo Fisher Scientific

  1. Accelerating Science
  2. Learning at the Bench
    3. /
  3. 分子生物学実験関連
    4. / シーケンスの波形がでない？試してみたい2つのこと！

シーケンスの波形がでない？試してみたい2つのこと！

Written by | Published: 05.14.2020

はじめに

シーケンサーを用いてDNAシーケンシングを行った際に、結果を見てみると、「波形がでていない」や「波形はでているが、複数重なっていて汚い」といったようなデータトラブルの経験はないでしょうか。

図1．データトラブル例

DNAシーケンシングの結果には試薬や装置、サンプルなどのさまざまな要因が影響するため、波形がでていないシーケンス結果のみでは、原因を特定することはなかなか難しいです。そこで今回は、シーケンスデータのトラブルシュートの第一歩として、簡単に試せる2つの確認方法をご紹介します。
▼こんな方におすすめです！
・シーケンスの波形がきれいにでなくてお困りの方
・データトラブルの原因が装置にあるのではないかと不安な方
・新しく始める実験の手順を確認するための陽性コントロールをお探しの方

試したいこと　その1：Sequencing Standardをランしてみる！

Sequencing Standardとは、主にシーケンサーのメンテナンスの1つである「Spectral Calibration」を実施する時に使用する試薬です。Sequencing Standardには、既にシーケンス反応済みの約1200 bpのDNAが含まれています。Hi-Di Formamideで溶解するだけで、シーケンサーでランできるようになりますので、試薬調製が非常に簡単です。
また、PCRやシーケンス反応後の精製などをせずに、シーケンスができますので、Sequencing Standardの結果にもデータトラブルが見られるのであれば、装置側にその原因があると判断できます。この場合、装置消耗品の交換や装置メンテナンスなどでデータの質が改善することも多いです。
一方、Sequencing Standardをランした結果、きれいな波形が得られれば、装置側に原因はないと判断することができます。なお、Sequencing Standardはご使用のシーケンサーの機種により、適切なものを選択していただく必要があります。ご注意ください。

図2．良好なシーケンス結果例

試したいこと　その2：シーケンシングキット付属のコントロールをランしてみる！

弊社のシーケンシングキットには、コントロールDNA【pGEM-3Zf(+)】とそのプライマー【–21M13Primer】が付属しています。このコントロールDNAとプライマーは、シーケンス反応～ランの陽性コントロールとして使用できます。

使用方法は簡単で、サンプルDNAの代わりにコントロールDNA、サンプルDNA用のプライマーの代わりにコントロール用プライマーを、マスターミックスと混ぜてシーケンス反応を行います。その後の精製からシーケンサーでのランはサンプルDNAと同様に行います。このコントロールDNAの結果が悪ければ、使用した試薬の劣化や、反応条件や処理方法など、反応自体に原因があると推測できます。一方、コントロールDNAの結果に問題がなければ、サンプルDNAやプライマーに原因があると判断できます。

このように、キット付属のコントロールを一緒に反応させておくだけで、大した手間もなく、シーケンス結果のトラブルシュートに役立つ情報を得ることができます。

シーケンスデータから推測できることも！

DNAシーケンシングでは、そのワークフローのどの段階においてもデータトラブルの原因が発生する可能性があります。

図3．シーケンスワークフロー

さらに、シーケンスデータを検証することにより、その波形のパターンなどから原因を推測できる場合もあります。サンプルとコントロールの結果や実験手順、同じトラブルが再現するかなど、さまざまな要素を総合的に考慮することで、トラブルシュートに繋げることができます。

まとめ

・データトラブルの際は、Sequencing Standardをランしてみる！
・キット付属のコントロールも陽性コントロールとして有用！
・シーケンスデータやプロトコルなどから、総合的に判断する！

［無料公開中］サンガーシーケンスの基礎

シーケンスのワークフローやデータからのトラブルシュートについては、こちらのガイドにも詳しい記載がございます。ぜひご活用ください。

ダウンロードする

 

研究用にのみ使用できます。診断用には使用いただけません。

記事へのご意見・ご感想お待ちしています

  • サーモフィッシャーサイエンティフィックジャパングループ各社は取得した個人情報を弊社の個人情報保護方針に従い利用し、安全かつ適切に管理します。取得した個人情報は、グループ各社が実施するセミナーに関するご連絡、および製品／サービス情報等のご案内のために利用させていただき、その他の目的では利用しません。詳細は個人情報の取扱いについてをご確認ください。
  • 送信の際には、このページに記載のすべての注意事項に同意いただいたものとみなされます。