組織サンプルのマルチプレックスイメージングのためのEVOS S1000 Spatial Imaging System

皆さん、おはようございます、あるいはこんばんは。 私の名前はAdyary Fallareroです。サーモフィッシャーサイエンティフィックでイメージングテクノロジーの製品管理を担当しています。 私はフィンランドにいます。 皆さん、こんにちは。 私の名前はChris Langsdorfです。サーモフィッシャーサイエンティフィックでタンパク質と細胞分析のグローバル・プロダクト・マネージャーをしています。米国にいます。

今日は、空間プロテオミクス研究のためのマルチプレックスイメージングを進歩させるために、私たちの会社が最近開発した新しいツールについてお話しします。 空間生物学に関する新たな知識を得ていただければ幸いです。 その後、さらに多くの情報が必要な場合や、質問がある場合は、遠慮なく私たちおよび研究チームまでご連絡ください。

それでは始めましょう。

さっそく、空間プロテオミクスにおけるマルチプレックスイメージングの課題に取り組むための新しいツールについて見ていきましょう。 本日のアジェンダは、空間生物学の革命について簡単に説明し、マルチプレックスを用いたプロテオミクスイメージングを検討し始めたときに生じるいくつかの課題を検証し、サンプルのラベリングとイメージングおよび解析技術の両方を用いて、これらの課題にどのように対処してきたかを議論することです。

空間生物学は、単一細胞だけでなく、より大きな環境における文脈も分析できるため、サンプルについてより深い洞察を与えてくれます。 抗体を用いた検出によって、どのような種類の細胞が存在し、代謝状態や活性化状態といった細胞の状態や、どのような機能を担っているのかを知ることができます。 サンプルは一般的に固定されているので、時間的にも空間的にもその同一性を把握することができます。 複数の種類の細胞を同時に研究することで、それらの細胞の相互作用や、それらがより大きく複雑な近隣やネットワークをどのように形成するかを理解できます。

私たちは、組織の微小環境と、本来の状態のサンプルの構造の両方を理解し始めるでしょう。 この仕組みの一例を見てみましょう。 組織切片全体を画像化し、サンプルの一部分を拡大して空間的バックグラウンドを理解できます。 また、複数の異なる色を表示することで、異なるタイプの細胞が本来の環境に存在する位置が見れます。 その後、解析ツールを使って、抗体ベースの検出で標識した異なる細胞タイプを同定することもできます。 さらに一歩踏み込んで、「これらの細胞タイプにもっとも近い細胞は？」といった質問をすることで、 サンプルのネットワークと構造をより詳細に理解し始めることができます。

このタイプの空間ワークフローに切り替えると、いくつかの課題が発生します。 一般的に、顕微鏡実験では、一次抗体の後に蛍光標識した二次抗体を使用します。 抗体ベースの標的が3つか4つから8つになると、二次抗体はもはや役に立たなくなります。 標識済み一次抗体を使用する必要があるということです。 ここに見られるように、一次抗体を標識するワークフローは非常に迅速です。 これらの抗体すべての混合液を作り、約1時間以内にサンプルを標識できます。 ただし、これら標識で利用できるカタログ製品は一般的に限られているなど、いくつかの欠点があります。 二次抗体を用いた3つまたは4つの標的の検出とは異なり、ここでは、常に3つか4つのもっとも明るい色素を選択しますが、必ずしも明るさではなく、スペクトルの特性に基づいて色素を選択する必要があります。

幸いなことに、Aluora Spatial Amplification Reagentには、この課題に対する解決策があります。 ここでは、3段階のワークフローを使用します。 まず、一次抗体でサンプルを標識し、洗浄後、HRP標識された二次抗体で標識します。 この後、Aluora Spatial Amplification reagentを添加します。この試薬は、抗体が結合する場所にサンプルと共有結合します。 このステップの後、すべての抗体はサンプルから取り除かれ、元々存在していた各抗原の位置に非常に明るい蛍光標識だけが残ります。 左側に見られるように、1回の標識の後、目的の1つの抗原の位置を確認することができます。 これを繰り返すと、2つ目、3つ目、4つ目、そして最大8つの色が、高感度かつ、非常に明るい信号で見えるようになります。 このため、抗体の選択と使用方法には多くの柔軟性があります。 増幅が行われるため、抗体の使用量は大幅に少なくなり、抗体に色素を共有結合させる必要もありません。 この欠点は、ワークフローが長くなることで、何度もラベリングサイクルを繰り返さなければならなりません。

Aluora Spatial Amplification Reagentは、標識一次抗体と互換性があります。 この2つの例では、一次抗体をAlexa Fluor 647や594といった、もっとも明るい色素で標識しています。 輝度の低い色素や発現量の低い抗原の場合、Aluora Spatial Amplification Reagentに切り替えると、バックグラウンドに対して必要なシグナルが得られます。 標識済み一次抗体の入手に関しては、カタログから入手する以外にいくつかの方法があります。 まず、これらは自分たちの手で標識が可能です。 精製キットが利用可能で、システムと互換性のある色素で標識が簡単に行えます。またキットを用いて実験系を組み立てる、あるいはReadyLabelと呼ばれる当社の技術を使用することもできます。 ReadyLabelは抗体を標識し、かつ、その後これら8種類の色素のうちの1つで標識します。 あるいは、抗体を弊社にご送付いただければ、弊社の専門家が標識して返送いたします。 これらのオプションには、多くの柔軟性と利便性があります。 しかし、カタログから標識抗体を入手するよりも少し高価になる可能性があります。

空間プロテオミクス研究を推進するために我々が開発してきた標識ツールを共有してくれたChrisに心から感謝します。 ここで少し話を変え、装置、特に蛍光顕微鏡に焦点を当てましょう。 皆さんは、単一細胞が組織の微小環境において、どのような形で組織を構成しているかを調べるために、蛍光顕微鏡が使用可能であり、また広く使用されてきたことをよくご存知だと思います。 すべてに長所と短所があります。 私たちが試みたことは、現在利用可能な装置の欠点のいくつかに取り組み、空間生物学の科学者が実施できる研究の種類を進歩させることです。 まず、現在利用可能な技術の概要と、既存の技術の限界にどのように対処してきたかを説明します。

空間プロテオミクスに関する研究の多くが、標識とイメージングを繰り返し、解析を行ってきたことは、皆さんよくご存じだと思います。 このアプローチで行われる画像処理は、実にオーソドックスなものです。 これらの装置で使用される蛍光チャンネルは2つから4つです。 このアプローチの利点は、複数回イメージングを行うため、多くの標的タンパクを調べられることです。 一方、欠点は、イメージングを繰り返すため、スループットが低くなりがちであること、また、サンプルに一定の照明を当てることと色素のストリッピングを繰り返すため、組織の完全性が損なわれる可能性があることです。

このような限界に対処するため、私たちが試みたアプローチが、スペクトルイメージングです。 スペクトルイメージングでは、1回のラウンドで同時に蛍光を捕らえることができます。 スペクトルイメージングの目的は、従来の2～4チャンネル、場合によっては5チャンネルの蛍光を一度に捕らえるのではなく、7～10チャンネル、場合によってはそれ以上の蛍光を一度に捕らえることです。 組織サンプルの保存性がよくなるという利点があります。 しかし欠点もあります。その欠点とは、1回の撮像で取得される蛍光色素が非常に多い場合、蛍光の漏れ込みが発生し、それを除去する必要があるという事実です。

なぜこのような欠点が生じるのか、そしてその原因はどこにあるのかをもう少し理解すれば、問題の根本原因を突き止めることができます。 その根本的な原因は、空間イメージングに使用される蛍光色素の大部分が非常に広い発光スペクトルを持つためです。 ECADを514のチャンネルで撮像している場合、514の発光スペクトルは、488など、隣接する両方のチャンネルにも現れ、表示されます。 その信号を分解し、漏れ込みを除去するために、アンミキシングと呼ばれる数学的処理が適用できます。 アンミキシングは比較的簡単なプロセスで、特定のプロトコルで使用される各蛍光色素が画像の各ピクセルに与える相対的な寄与度を確立します。 これは、生物学的サンプルに見られる典型的な自家蛍光を考慮するために、染色されていない組織からスペクトルシグネチャーを取得し、次にアッセイを実施する同じ組織上の個別に染色された蛍光色素からスペクトルシグネチャーを取得することによって行われます。

この方法を用いれば、蛍光スペクトルのシグナルが重なっていても、タンパク質の標的を容易に分離・識別することができます。 ここに示した一番下の画像でわかるように、514チャンネルのECADは、隣の2つのチャンネルに現れるCD163とPD1シグナルから非常に明確に識別できます。 分光技術に伴うこの主な欠点こそ、私たちが新しい装置で解決したいと心から望んでいたものです。 当社の新しい装置は、Invitrogen EVOS S1000 Spatial Imaging Systemというものです。 私たちは、アンミキシングのワークフローをシンプルにし、非常にわかりやすくすることに多くの注意を払ってきました。 また、画像取得の一部であるかのように実行されます。 私たちは、アンミキシングの品質も検証しています。 ユーザー様が実行されたアンミキシングの品質を理解できるように、品質レポートの一部として実質的なデータを提供しています。

アンミキシングワークフローを改善するだけでなく、現在のスペクトルイメージング装置で遭遇する他の課題にも取り組んでいます。 そのひとつが、非常に特殊な標識方法に制限されることが多いという事実です。 私たちはEVOS S1000で使用できる種類と技術の種類を増やしました。 また、9プレックスの画像を取得するために何時間も費やす必要がないよう、迅速さも追求しています。 1ラウンドですぐに画像が取得できます。 EVOS S1000は、20倍で1ピクセルあたり325 nmの高解像度を維持しながら、最大8つの標的タンパク質とDAPIを取得し、9プレックスにすることができます。 最後になりましたが、空間プロテオミクスと空間生物学をより多くの人々が利用できるようにすることで、より多くの研究者が空間生物学を活用し、これらのツールを用いて生物学的プロセスを研究できるようになります。 私たちは、完全ではありませんが、よりシンプルにしようとしています。

それでは、現在あるイメージングの課題を見ていきましょう。 まず1つ目は、アンミキシングは多くの場合、独自に開発された非常に特殊な色素に限定される傾向があることです。 私たちはその問題に対処しようとしました。 EVOS S1000でプロトコルを作成すると、Alexa Fluor、Alexa Fluor Plus、およびAluora Spatial Amplification Reagentやその他の特別な増幅試薬を含む、およそ30種類の色素のレパートリーが表示されます。 色素を選択すると、ソフトウエアが、選択した色素の発光スペクトルに存在する重なりを表示します。 そして、青で示したプライマリチャンネルと、スペクトルの近接による漏れ込みを排除するために必要なサポートチャンネルを取得するチャンネル構成を自動的に設定します。 これはユーザーの入力なしで、完全に自動的に行われます。 ユーザーはアッセイでプロダクトターゲットを定義することもできます。

私たちが取り組もうとしたもうひとつの課題は、7プレックス以上のものに対してアンミキシングを行うことの複雑さへの対処です。 私たちのソリューションは、プレックスに関係なく同じアンミキシングワークフローを使用します。 7プレックスになっても、9プレックスになっても、ワークフローは変わりません。 まず、画像からスペクトルデータを抽出し、アンミキシングマトリックスを生成する必要があります。 ユーザー様は、まず、染色していない組織スライドの画像を取得し、次に個々の単色キャリブレータースライドの画像を取得する必要があります。 そうすれば、そのプロトコルを利用して、9プレックスアッセイの設定を始めることができます。 システムは全視野の画像取得を開始し、同時に画像取得ワークフローの一環としてアンミキシングが実行されます。 20倍の倍率で、1平方センチメートルの9プレックス画像を取得し、OMETファイル形式で完全にアンミックスしてステッチするのに約1時間かかります。

アンミキシングワークフローは、後処理の必要性を排除します。 ユーザー様は、自分のアンミキシング処理の質を主観的に評価するだけではいけません。 私たちはこの問題に対処するため、アンミキシングの品質が分かるレポートを作成できるようにしました。このレポートには、定性的評価のための生画像とアンミキシング画像の比較、およびユーザー様がアンミキシングの品質を推定できる定量的パラメータの両方が含まれています。 必要に応じて、アンミキシングプロセスを改善するための明確なカットオフ値とトラブルシューティングのヒントを提供します。

私たちは、顕微鏡実験に必要なシステムや方法はすべて、この分野に初めて触れるユーザーにとってもシンプルで直感的である必要があると考えています。 ペリスコープモードと呼ばれる独自の機能があり、ユーザーはどのチャンネルでもオンにして組織を探索することができ、新規ユーザー様が実用的かつシンプルに導入しやすくなっています。 誰でもすぐに自信を持って、9プレックスのセットアップ、取得、可視化を簡単に行えるよう、洗練されたシンプルさを提供することを目指しています。

EVOS S1000は、複数の標識方法で利用することができます。 Aluora special amplification reagentを用いて得られた結果の例では、発現の低い標的タンパク質を容易に識別できる非常に明るいシグナルを示しています。 EVOS S1000は標識済み一次抗体にも使用でき、アンミキシングとOME TIFFファイルを生成するためのデータ処理を含め、20倍の倍率で約2時間以内に完了する迅速な標識ステップを可能にします。 標識済み一次抗体が入手できない場合、ReadyLabelキットを用いて一次抗体を直接標識する方法もあります。 このアプローチはEVOS S1000と互換性があり、標識方法の柔軟性を提供します。

EVOS S1000 Spatial Imaging Systemは、空間イメージングの分野における新しい選択肢です。 私たちは、手間のかかるアンミキシングワークフローの複雑さを伴わずに、1回の検出でマルチプレックスイメージングを達成する選択肢を提供することを目指しています。 私たちは、空間増幅試薬や検証済みの標識一次抗体を使用する際の品質指標や柔軟性を提供し、シンプルで信頼性の高いものを作りました。 空間生物学の旅のパートナーとして、どんな質問にも喜んでお答えします。 ご参加いただきありがとうございました。