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SuperScript IV One-Step RT-PCR System
Obtenha resultados superiores de RT-PCR
Mesmo com amostras de RNA desafiadoras, você pode obter melhores resultados com mais rapidez e facilidade do que com qualquer outro reagente RT-PCR de uma etapa. SuperScript IV One-Step RT-PCR System combina a alta capacidade da Invitrogen SuperScript IV Reverse Transcriptase (RT) com a alta fidelidade da Invitrogen Platinum SuperFi DNA Polymerase para fornecer desempenho superior de RT-PCR de uma etapa.
Destaques
- Mecanismo de ativação hot-start em duas fases para alta especificidade, melhor rendimento e fácil configuração da temperatura ambiente.
- Desempenho inigualável com sensibilidade de até 0,01 pg de RNA, comprimento alvo de até 13,8 kb e o protocolo RT-PCR mais rápido em uma etapa
- Detecção de alvos confiável mesmo em amostras de RNA com pureza subótima
- Remoção rápida e fácil de gDNA para maior precisão e confiança em seus resultados
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Vantagens do SuperScript IV One-Step RT-PCR System
Com o inovador mecanismo de ativação hot-start em duas fases, o SuperScript IV One-Step RT-PCR System gera um produto específico com rendimentos elevados em metade do tempo de reação em comparação com outros kits comerciais.
Figura 1. Amplificação de alvos longos com alta especificidade em um tempo significativamente menor. Detecção de alvo de 7.8 kb do total HeLa RNA usando o SuperScript IV One-Step RT-PCR System, Invitrogen SuperScript III One-Step RT-PCR System com Platinum Taq de alta fidelidade e o fornecedor QI, N, QU, Produtos RT-PCR de uma etapa T, R e BL. As reações foram realizadas de acordo com as recomendações do fornecedor. Os tempos totais de reação RT-PCR em uma etapa são indicados em horas:minutos. O alvo de RNA não conseguiu amplificar com produtos dos fornecedores QI e BL.
A alta sensibilidade do SuperScript IV One-Step RT-PCR System de um passo permite a detecção de alvos RNA de baixa abundância. A alta sensibilidade é vantajosa em experimentos em que há uma quantidade limitada de material inicial ou a concentração de RNA alvo na amostra é baixa.
Figura 2. Alta sensibilidade e detecção confiável de alvos a partir de baixas quantidades de RNA de entrada. Amplificação de fragmento de 0.35 kb de 0.01 pg, 1 pg, 10 pg, 10 ng e 100 ng de HeLa RNA total com o SuperScript IV One-Step RT-PCR System, SuperScript III One-Step RT-PCR System com Platinum Taq de alta Fidelidade e fornecedor QI, N, QU, T, BL e R Produtos RT-PCR de uma etapa.
Devido à alta capacidade de processamento do SuperScript IV RT e da Platinum SuperFi DNA Polymerase, o SuperScript IV One-Step RT-PCR System permite a detecção de uma ampla gama de comprimentos-alvo.
Figura 3. Versatilidade numa vasta gama de comprimentos-alvo. Detecção de fragmentos de RNA humano que variam de 0.2 a 13.8 kb com o SuperScript IV One-Step RT-PCR System.
O sistema SuperScript IV One-Step RT-PCR System de um passo é capaz de suportar o efeito de inibidores comuns de RT e PCR, como compostos copurificados de amostras biológicas ou reagentes usados para purificação de RNA. Este sistema excepcionalmente robusto minimiza a dependência da pureza da amostra de RNA para resultados confiáveis.
Figura 4. Resistência aos inibidores. Detecção de um alvo RNA de 1 kb do RNA total de HeLa usando o SuperScript IV One-Step RT-PCR System, o SuperScript IV One-Step RT-PCR System, SuperScript III One-Step RT-PCR System com Platinum Taq de alta fidelidade e o fornecedor QI, N, QU, T, BL e R Produtos RT-PCR de um passo em misturas de reação que contenham:
1–sem inibidor
2–heparina (0.18 µg/UL)
3–Xylan (2.5 µg/UL)
Ácido 4-húmico (0.02 µg/UL
5–LiCl (2 µg/UL).
Todos os kits, exceto o SuperScript IV One-Step RT-PCR System de um passo, foram inibidos com quantidades indicadas de inibidores.
A estabilidade das reações SuperScript IV One-Step RT-PCR em temperatura ambiente por um tempo prolongado permite aplicações de alta produtividade.
Figura 5. Estabilidade estendida em temperatura ambiente. Reações RT-PCR em uma etapa duplicadas de 0.35 kb de alvo RNA de 1 e 10 pg de RNA total de HeLa foram montadas usando reagentes SuperScript IV One-Step RT-PCR e deixadas em temperatura ambiente por até 4 horas antes do ciclo. Mesmo após 4 horas em temperatura ambiente, foi obtida uma amplificação alvo altamente eficiente e específica. NTC: Controle sem modelo.
- Métodos de purificação de RNA, incluindo protocolos com digestão DNase na coluna, muitas vezes não conseguem remover o gDNA completamente. A amplificação de gDNA contaminante pode causar resultados de RT-PCR não específicos ou enganosos em uma etapa.
- Os protocolos tradicionais de descontaminação de gDNA com DNase I incluem etapas demoradas de inativação ou remoção de DNase sob condições que podem danificar o RNA e afetar os resultados.
- O novo sistema SuperScript IV One-Step RT-PCR System com enzima ezDNase permite a eliminação eficiente, rápida e suave (5 min a 37 oC) do gDNA de amostras de RNA e garante a mais alta precisão e confiança em resultados de RT-PCR de um passo.
Sistema RT-PCR de uma etapa IV sobrescrito com enzima ezDNase
Com sua alta robustez, o sistema SuperScript IV One-Step RT-PCR System pode amplificar vários alvos na mesma reação multiplex de uma etapa RT-PCR com alta eficiência e especificidade.
Figura 6. Amplificação simultânea de até 4 alvos usando o sistema RT-PCR de uma etapa SuperScript IV. Um ou mais alvos de tamanhos crescentes (528, 997, 3,009 e 4,497) foram amplificados utilizando-se o RNA HeLa total como modelo.
Perguntas frequentes
A temperatura ideal de recozimento para seus primers pode diferir significativamente ao usar o SuperScript IV One-Step RT-PCR System em comparação com outros produtos RT-PCR de uma etapa devido a diferenças na concentração de sal de tampão. Utilize sempre a calculadora T m (thermofisher.com/tmcalculator) para determinar os valores T m e a temperatura de anelamento recomendada para os primers.
As condições de ciclo do RT-PCR com o SuperScript IV One-Step RT-PCR System diferem significativamente de outros produtos RT-PCR de uma etapa. Para obter os melhores resultados, sempre use as condições de ciclismo descritas no manual do SuperScript IV One-Step RT-PCR System.
Boas práticas laboratoriais são importantes para RT-PCR de fragmento longo e etapa única. Estas incluem a utilização de templates de alta qualidade (puros, frescos e intactos) e soluções de primário fresco. As etapas de otimização a serem consideradas incluem tempos de extensão mais longos, conforme recomendado nos protocolos e quantidades crescentes de templates. Saiba mais sobre a otimização e configuração da reação RT-PCR visitando nossos recursos educacionais de transcrição reversa.
Com o sistema SuperScript IV One-Step RT-PCR System de um passo, a síntese de cDNA pode ser realizada a temperaturas mais elevadas do que com outros produtos RT-PCR de um passo. Para modelos de RNA ricos em GC ou estruturalmente complexos, recomenda-se aumentar as temperaturas de incubação da síntese de cDNA até 55–60 oC
O mecanismo de hot-start de duas fases garante a ativação sequencial das enzimas RT e PCR no fluxo de trabalho RT-PCR de uma etapa. Em temperatura ambiente, o SuperScript IV RT é mantido inativo com um RT-Blocker sensível ao calor. Durante a primeira fase de ativação de arranque a quente a aproximadamente 45 oC, o bloqueador de RT é liberado e a síntese de cDNA de primeiro filamento é iniciada. Durante a segunda fase de ativação, a reação é aquecida a 98 oC para ativar a Platinum SuperFi DNA Polymerase e, simultaneamente, desativar o SuperScript IV RT. Este mecanismo separa as atividades das enzimas RT e PCR, proporcionando a mais elevada especificidade e rendimento RT-PCR.
A Platinum SuperFi DNA Polymerase no SuperScript IV One-Step RT-PCR System produz produtos de PCR de ponta cega que podem ser clonados diretamente em vetores de clonagem de ponta cega. A clonagem de TA também é possível se forem adicionadas projeções da de 3" após o PCR. Saiba mais sobre o uso de diferentes enzimas de PCR para a aplicação de clonagem visitando os recursos educacionais de PCR.
Recursos
Manuais
Ferramentas
Calculadora de Tm
As regras de temperatura de recozimento para a polimerase de DNA Platinum SuperFi são diferentes de muitas polimerases de DNA comuns (como Taq DNA polymerase). Para obter os melhores resultados do RT-PCR de uma etapa com o SuperScript IV One-Step RT-PCR System, use a calculadora T m em nosso site.
Informe técnico
Recursos técnicos de transcrição reversa
Saiba mais sobre fundamentos da transcrição reversa, considerações de configuração, importância da escolha da polimerase de enzima, métodos e aplicações comuns e solução de problemas.
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.