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Cuantificación rápida, precisa, sensible y específica de ADN, ARN, proteínas y endotoxinas
La cuantificación de ácidos nucleicos y proteínas es importante para aplicaciones posteriores como secuenciación de última generación (NGS), la PCR, la transfección, la inmunoelectrotransferencia y los inmunoensayos, entre otras. Los fluorímetros Qubit 4 y Qubit Flex cuantifican estas dianas mediante la detección de colorantes fluorescentes en una variedad de ensayos Qubit que se unen específicamente a sus moléculas diana. Las mediciones son precisas, exactas y sensibles y el proceso es rápido y sencillo.
Tecnología de cuantificación por fluorescencia Qubit
Los fluorímetros Qubit detectan colorantes fluorescentes en ensayos Qubit que son muy específicos de una molécula de interés en sus muestras. Estos colorantes emiten fluorescencia únicamente al unirse a sus dianas, incluso en concentraciones bajas, por lo que las lecturas también son muy sensibles. Los colorantes se absorben en cuestión de minutos y se pueden leer en segundos mediante fluorímetros Qubit, que interpolan las lecturas en una curva estándar.
La tecnología de fluorescencia Qubit es tan sensible que los ensayos Qubit requieren tan solo 1 µL de muestra, aunque la muestra esté muy diluida. Esto los hace ideales para cuantificar muestras valiosas.
Preciso, específico y sensible
Tanto los fluorímetros Qubit 4 como Qubit Flex ofrecen medidas de cuantificación rápidas y precisas de la molécula específica que están diseñados para detectar, incluso en cantidades extremadamente pequeñas. Por ejemplo, Qubit puede emplearse en ensayos de ADN para detectar moléculas de ADN dsADN o ssADN. Estos ensayos tienen un elevado nivel de selectividad para su tipo de ADN diana, incluso en presencia de ARN u otro tipo de ADN o de contaminantes comunes, como sales, nucleótidos libres, disolventes, detergentes y proteínas.
Cuantificación del ADN
En este análisis, el ensayo Qubit de dsADN HS (alta sensibilidad) demostró un intervalo de detección lineal de 0,2 a 100 ng y una selectividad para el ADN bicatenario (dsADN), incluso en presencia de una masa equivalente de ARN.
La exactitud y la precisión se evaluaron en los fluorímetros Qubit 4 y Flex, así como en el instrumento de una marca de la competencia, con el Qubit dsDNA HS Assay y el Qubit dsDNA BR (Broad Range) Assay, que se optimiza para detectar concentraciones más elevadas de dsADN. Tanto la exactitud como la precisión fueron mayores para los instrumentos Qubit que para los de la competencia y el instrumento Qubit Flex es el que ofreció un mayor rendimiento.
En una publicación independiente de 2013 de PLoS One, Simbolo et al. informaron de que la cuantificación fluorimétrica Qubit era un método fiable y rentable para cualificar varios preparados de ADN para NGS, incluidos los derivados de muestras de tejido congelado y FFPE. De los instrumentos que probaron, sus datos mostraron que los resultados de cuantificación de ADN que se obtuvieron mediante el fluorímetro Qubit contaban con un elevado nivel de reproducibilidad y eran coherentes con los datos de PCR cuantitativa en cuanto a la cantidad de ADN, incluso en el caso del ADN parcialmente degradado de muestras de FFPE.¹
1 Simbolo M, Gottardi M, Corbo V, et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 2012; 8: e62692. Texto completo
Cuantificación del ARN
Qubit proporciona ensayos de ARN para detectar moléculas de ARN grandes e intactas (como ARNr o ARNm grandes) y moléculas de ARN pequeñas e intactas (como microARN y siARN). Estos ensayos cuentan con un elevado nivel de selectividad para el tipo de ARN, incluso en presencia de ADN u otro tipo de ARN o de contaminantes comunes. En esta prueba de sensibilidad, los ensayos Qubit tanto de ARN como los de microARN se midieron muy cerca de las concentraciones reales de sus ARN objetivo.
Más sensible y selectivo que la absorbancia UV
Los fluorímetros Qubit son órdenes de magnitud más sensibles que la absorbancia UV, un método alternativo que puede cuantificar los ácidos nucleicos debido a su absorción de luz ultravioleta a 260 nm. Históricamente, los espectrofotómetros que miden la absorbancia UV no podían discernir las diferencias entre el ADN, el ARN, los nucleótidos libres, el exceso de sales y otros compuestos orgánicos, ya que todos ellos absorben a esa longitud de onda.
Aunque los algoritmos de software avanzados en los instrumentos UV-Vis (ultravioleta/visible) que analizan más espectro pueden diferenciar correctamente el ADN del ARN, todavía no pueden distinguir el dsADN del ssADN o el ARNr del microARN. Además, la espectrofotometría UV a menudo no tiene la sensibilidad para medir con precisión bajas concentraciones de ADN y ARN.
Nota: Aunque la absorbancia UV no es tan sensible o selectiva como la fluorometría en la cuantificación de ácidos nucleicos o proteínas, es excelente para detectar impurezas en una muestra. Muchos laboratorios utilizan ambas tecnologías para diferentes fines. Compare ambas y consulte nuestros espectrofotómetros NanoDrop en la página de cuantificación de ARN/ADN.
2. Simbolo M, Gottardi M, Corbo V, et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS ONE. 2013; 8: e62692. Texto completo
Sencillo y rápido
Los fluorímetros Qubit son sencillos y fáciles de manejar: solo hay que seguir las instrucciones detalladas que aparecen en la pantalla. Incluso hay una calculadora integrada para determinar la cantidad exacta de colorante y tampón que se debe utilizar, en función del número de muestras y patrones que se estén analizando. El vídeo siguiente muestra el proceso, sencillo e intuitivo.
Después de haber aislado sus muestras de ADN, ARN o proteínas, mézclelas con colorante y tampón en las proporciones recomendadas y pipetéelas en los tubos de ensayo o tiras de tubos. De la misma manera, prepare sus dos (o tres) patrones, que puede utilizar con varias muestras. Una vez que se inicia el análisis, el instrumento tarda tan solo unos segundos en informar de los resultados.
A continuación, puede exportar los resultados a una cuenta de Thermo Fisher Connect Cloud a través de WiFi o transferir un archivo CSV estándar a un ordenador mediante una unidad o cable USB.
Si necesita procesar bastantes muestras, utilice el Qubit Flex Fluorometer para aumentar el rendimiento. El gráfico siguiente muestra el tiempo de adquisición de los datos, incluida la preparación de muestras y la medición, de una cantidad determinada de muestras con el fluorímetro Qubit 4 o Flex, así como el de un instrumento de la competencia.
Sugerencia: Para la cuantificación de alto rendimiento, considere la posibilidad de utilizar un lector de microplacas con capacidades de fluorescencia.
Los lectores de microplacas multimodo Thermo Scientific Varioskan ALF y Varioskan LUX son compatibles con los ensayos Quant-iT para cuantificar los mismos analitos que los fluorímetros Qubit y los ensayos Qubit. Para obtener una comparación, consulte nuestra página sobre cuantificación de ARN/ADN.
Calculadoras integradas para la preparación de muestras y las aplicaciones posteriores
Todos los fluorímetros Qubit incorporan una calculadora de reactivos integrada, que le ayuda a determinar cuánto reactivo y tampón debe utilizar para preparar su solución de trabajo en función del número de muestras y patrones que vaya a analizar. Sirve también para determinar volúmenes de mezcla maestra para muestras y patrones.
Reagent calculator
El Qubit Flex Fluorometer ofrece tres calculadoras adicionales para agilizar el flujo de trabajo. En el ámbito de preparación de la muestra para el ensayo que ha seleccionado, la calculadora de rango de ensayo muestra el rango principal de concentración de la muestra para el que es más preciso, así como los intervalos altos y bajos ampliados, según el volumen de la muestra.
Para facilitar su transición a aplicaciones posteriores, concretamente a NGS, dos calculadoras le ayudan a gestionar los datos de las muestras del ensayo y a llevar a cabo las conversiones y las diluciones a unidades comunes. La calculadora de la molaridad le permite determinar la molaridad de una muestra en función de la longitud del ácido nucleico y de la concentración medida. En el caso de las aplicaciones de secuenciación, la calculadora de normalización sustituye a la hoja de cálculo que sirve a menudo para normalizar las muestras durante la preparación de la librería. En cada ciclo recomienda cuánta cantidad de muestra y tampón se deben añadir para alcanzar una masa, concentración o molaridad normalizada deseada. Los resultados de ambas calculadoras se pueden exportar de forma sencilla directamente a una cuenta de Thermo Fisher Connect Cloud a través de Wi-Fi o en un archivo CSV estándar a un ordenador u otro dispositivo a través de una unidad USB o un cable Ethernet.
Software de compatibilidad con el cumplimiento de la norma 21 CFR Parte 11
La solución de software Qubit Flex SAE es un módulo de software opcional compatible con la norma 21 CFR Parte 11 de la FDA para el mantenimiento de registros electrónicos y la firma electrónica.
El cumplimiento de la norma 21 CFR Parte 11 se compone de requisitos técnicos y de procedimiento.
- Los requisitos de procedimiento son los procedimientos de funcionamiento estándar establecidos por la institución del usuario final
- Los requisitos técnicos son las características funcionales del software de gestión de conformidad empleado
La realización de los requisitos técnicos no garantiza el cumplimiento de la norma 21 CFR Parte 11 por sí sola. El cumplimiento es la consecuencia tanto del proceso de trabajo como de los sistemas utilizados por la institución.
Las capacidades del software incluyen la restricción de usuarios no autorizados, las directivas de contraseñas y las fechas de caducidad, los permisos y las funciones de usuario definidos, los registros y los informes de auditoría y los flujos de trabajo de firma electrónica integrados. Todos los fluorímetros Qubit Flex (firmware operativo v.1.7.0 o posterior) pueden ejecutarse en el modo SAE después de adquirir la licencia de software Qubit Flex SAE. Para lograr el cumplimiento de la norma 21 CFR Parte 11, la institución también deberá establecer y documentar los procedimientos operativos estándar.
Componentes
La solución de software Qubit Flex SAE consta de tres componentes que se comunican entre sí
- El software SAE se utiliza para configurar los ajustes de seguridad, auditoría y firma electrónica (SAE) para el Qubit Flex Fluorometer. El software SAE consta de la consola de administración SAE (instalada en un servidor informático en red con una dirección IP estática) y el perfil de aplicación SAE.
- La licencia SAE se utiliza para activar los ajustes de SAE para el Qubit Flex Fluorometer.
- El modo SAE se ejecuta en el Qubit Flex Fluorometer y se conecta de forma remota a la consola de administración SAE.
Componente 1: Software SAE: Consola de administración SAE
La consola de administración SAE es el componente de la solución de software Qubit Flex para compatibilidad con el cumplimiento de la norma 21 CFR Parte 11 que permite la configuración del instrumento Qubit Flex para que satisfaga los requisitos específicos del usuario. Es un componente modular y es compatible con otros instrumentos Invitrogen, por lo que el perfil de aplicación de Qubit Flex debe instalarse antes en la consola de administración SAE para que la configuración de SAE se pueda utilizar en el instrumento Qubit Flex. Una vez instalado el software del perfil de aplicación de Qubit Flex en la consola de administración SAE, se utiliza un servidor SAE (ordenador en red) para conectarse al instrumento Qubit Flex. La consola de administración SAE debe utilizarse desde un ordenador en red con una dirección IP estática.
Componente 2: Licencia SAE
La licencia de software Qubit Flex SAE para compatibilidad con la norma 21 CFR Parte 11 se utiliza con el Qubit Flex Fluorometer y es compatible con el cumplimiento de la norma 21 CFR Parte 11 de la FDA para seguridad, auditoría y firmas electrónicas (SAE) mediante la consola de administración SAE. Se necesita una licencia de software SAE para activar el modo SAE en cada instrumento Qubit Flex Fluorometer. Para que la licencia se active, Qubit Flex debe actualizarse a la versión de software 1.7.0 o posterior.
Componente 3: Modo SAE
Cuando se activa el modo SAE, el instrumento Qubit Flex se conecta a la consola de administración SAE a través del servidor SAE. La configuración de seguridad, auditoría y firmas electrónicas, tal como se definen en la consola de administración SAE, se implementa en el instrumento Qubit Flex Fluorometer.
Las características incluyen la restricción de usuarios no autorizados en el sistema, las directivas de contraseñas y las fechas de caducidad, los permisos y funciones de usuario definidos, los registros y los informes de auditoría y los flujos de trabajo de firma electrónica integrados. Todos los fluorímetros Qubit Flex (firmware operativo v.1.7.0 o posterior) pueden ejecutarse en modo SAE mediante la adquisición de la licencia de software Qubit Flex SAE.
Funcionalidad
Funcionalidad de la consola de administración SAE
| Seguridad del sistema | Controla el acceso de los usuarios al software mediante los ID de usuario, las contraseñas, las funciones y los permisos. Se proporcionan dos funciones de usuario predeterminadas, una con privilegios completos (Administrator [Administrador]) y otra con algunos privilegios eliminados (Scientist [Científico]). Las funciones de usuario predeterminadas se pueden editar; también se pueden crear funciones y permisos de usuario adicionales. |
| Auditoría | Lleva a cabo un seguimiento de las acciones realizadas por los usuarios y de los cambios en la configuración de la consola de administración SAE. Cuando la auditoría está activada, el software audita en segundo plano las acciones que producen cambios en los datos o en el instrumento. La opción para requerir que los usuarios introduzcan el motivo de la auditoría (razón para realizar una acción o un cambio) es posible. La función de auditoría proporciona informes sobre los cambios y acciones auditados de la consola de administración SAE. |
| Firma electrónica | Determina las funciones para las cuales los usuarios tienen que proporcionar un nombre de usuario y una contraseña. Puede configurar el evento de firma electrónica para que requiera varias firmas y para que lo firmen los usuarios con permisos específicos. |
Seguridad del sistema
El acceso está restringido al personal autorizado a través del ID de usuario y la contraseña.
Auditoría
La función de auditoría de la consola de administración SAE realiza un seguimiento de las acciones por parte de los usuarios y de los cambios en la configuración de SAE. Las acciones de las que se realiza un seguimiento en segundo plano son el inicio y cierre de sesión, la generación de datos y sus exportaciones.
Dentro de la función de auditoría, existen opciones para seleccionar si las acciones específicas de usuario se auditarán en segundo plano, de manera opcional u obligatoria. Además, se pueden generar informes para acciones de usuario, cambios del módulo SAE y acciones y eventos de software o instrumentos.
Firmas electrónicas
La función de firma electrónica de la consola de administración SAE determina las funciones para las que los usuarios deben cumplir los requisitos de firma.
Dentro de la función de firma electrónica, puede configurar cuántos usuarios con funciones diferentes deben firmar cada evento de firma electrónica. También puede crear significados diferentes y personalizar los requisitos de firma para cada uno.
Información de pedido
Para utilizar la solución de software Qubit Flex SAE con el Qubit Flex Fluorometer, puede adquirir una licencia de software de forma independiente o como parte de un paquete de licencia de instrumentos y software de Qubit Flex.
Si ya dispone de un Qubit Flex Fluorometer, compruebe que el instrumento tiene la versión de firmware 1.7.0 o posterior para activar esta opción.
Las instrucciones para generar una clave de licencia se encuentran en la Guía del usuario de SAE.
Amplia gama de ensayos y aplicaciones
La cuantificación de ácidos nucleicos es importante para aplicaciones de ADN y ARN posteriores como la NGS, la secuenciación de ARN, la PCR, la PCR cuantitativa, la clonación, la preparación de plásmidos y la transfección. La cuantificación de proteínas es importante para aplicaciones como la electroforesis de proteínas, la inmunoelectrotransferencia, la espectrometría de masas y los inmunoensayos.
Los ensayos Qubit Invitrogen emplean colorantes selectivos con dianas que emiten fluorescencia cuando se unen al ADN, al ARN o a la proteína. La medición de fluorescencia es más sensible y más específica que otros métodos como la absorbancia UV o los ensayos Bradford, que pueden sobreestimar las concentraciones de muestras debido a contaminantes como sales, disolventes, detergentes, proteínas y nucleótidos libres.
Existen ensayos Qubit para una amplia gama de aplicaciones de cuantificación:
Cuantificación del ADN
Los ensayos Qubit de ADN son muy específicos para el dsADN a través de dos rangos de concentración diferentes, para el ssADN y los oligonucleótidos.
Cuantificación del ARN
Los ensayos de ARN Qubit miden moléculas de ARNr y ARNm grandes en tres rangos de concentración diferentes o moléculas de ARN pequeñas como el microARN.
Integridad y calidad del ARN (IQ)
Un ensayo de cualificación único que calcula la relación entre ARN grande, intacto y/o estructurado y ARN pequeño y degradado.
Cuantificación de proteínas
Los ensayos Qubit de proteínas miden rápidamente el contenido de proteínas en dos rangos de concentración diferentes, ambos más amplios que los ensayos de cuantificación de proteínas tradicionales de Bradford.
Ensayos de detección de endotoxinas
Ofrece un ensayo terminal eficiente y fluorescente para cuantificar las endotoxinas en varios tipos de muestras como proteínas, péptidos, anticuerpos o muestras de ácidos nucleicos.
Ensayos de verificación del sistema
Rápidos, fáciles de usar y basados en reactivos que prueban el rendimiento de los fluorímetros Qubit 4 y Qubit Flex.
Ion Sphere Quality Control Kit
Diseñado especialmente para evaluar las partículas Ion Sphere (ISP) enriquecidas antes de la secuenciación en la máquina de genoma personal (PGM) o en el sistema Ion GeneStudio.
Ensayos MyQubit personalizados (solo Qubit 4)
Cree sus propios ensayos de cuantificación en el fluorímetro Qubit 4.
Modo de fluorímetro y ensayos personalizados MyQubit
En el modo Fluorímetro, el fluorímetro Qubit se puede utilizar como un minifluorímetro. En lugar de llevar a cabo una calibración de ensayo y calcular los resultados basándose en un algoritmo, el instrumento genera y muestra los valores de la unidad de fluorescencia sin procesar (RFU) de cada muestra.
En el modo Fluorímetro, puede elegir el LED azul o rojo como fuente de excitación. Si elige la excitación azul, el instrumento lee los valores de fluorescencia tanto en los canales de emisión verde como en los de color rojo lejano. Si elige rojo, la emisión se lee únicamente en el canal de color rojo lejano.
Modo de fluorímetro
Para acceder al modo Fluorímetro, pulse Fluorímetro en la pantalla de inicio. Elija si desea utilizar la fuente de excitación azul (470 nm) o roja (635 nm). Una vez que introduzca la muestra y seleccione Leer tubo, los resultados aparecerán en la pantalla en las RFU.
Ensayos MyQubit
Los datos que se recogen en el modo de Qubit 4 Fluorometer pueden servir para diseñar su propio ensayo mediante la herramienta de diseño de ensayos MyQubit. Esta herramienta permite crear nuevos ensayos personalizados para el Qubit 4 Fluorometer en minutos. Simplemente hay que introducir los parámetros de ensayo en la herramienta en línea y, a continuación, guardar y cargar el archivo .qbt en el fluorímetro Qubit mediante una unidad USB.
Hay Ensayos MyQubit configurados previamente disponibles para cuantificar el colesterol, la galactosa, la glucosa, el ácido glutámico, el peróxido o la sacarosa. Puede descargar estos archivos .qbt en el ordenador y, a continuación, cargarlos en el Qubit 4 Fluorometer mediante una unidad USB. A continuación se exponen algunos ejemplos de los tipos de ensayos MyQubit que puede crear por su cuenta.
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.