细胞群定量散点图

流式细胞分析为细胞特征的量化提供了一种快速方法。 然而,绝大多数的流式细胞分析并不能直接提供样品中细胞的浓度或绝对计数。 绝对细胞计数已被广泛应用于细胞群的量化以及疾病进展中,包括干细胞研究领域。 获取绝对细胞计数一般通过两种方法,一种是将来自血细胞分析仪中独立的细胞浓度测量装置与流失细胞分析的群体数据相结合(多平台检测),另一种向流失细胞样品中加入内部微球计数标准品(单平台检测)。 单平台检测的方法因其更为简单,且不会出现实验室间的波动差异或低估,相对于多平台检测更为准确,因而受到了更多的青睐。

我们可提供两款用于细胞计数的产品—Invitrogen CountBright 绝对计数微球以及 Invitrogen AccuCheck 计数微球。此外,我们还提供一种可利用流式细胞仪,即便在含有多种种类细菌的混合菌群情况下,仍可对活菌或死菌进行有效鉴定并定量的 Invitrogen LIVE/DEAD BacLight 细菌活性及计数试剂盒。

哪种计数产品更适合您的实验?

  CountBright 绝对细胞计数微球 AccuCheck 计数微球 LIVE/DEAD BacLight 细菌活性及计数试剂盒
样品类型 任意类型,包括全血 任意类型 细菌样品
微球大小 7 µM Bead A: 6.40 µM
Bead B: 6.36 µM
6 µM
激发 (nm) UV 至 635 nm Bead A: 488
Bead B: 635
不发荧光
最大发射波长 (nm) 385 至 800 Bead A: 575–585
Bead B: 660–680
NA
测量参数 细胞数量 细胞数量及移液精准度 活细菌区域(或死细菌区域)事件数量,以及微球区域事件数量
货 号
C36950 PCB100 L34856

CountBright绝对计数微球

  • 可上样广泛的荧光染料,因而可与市售的所有仪器相兼容
  • 具有兼容多种细胞类型的易用实验方法,包括裂解或未洗涤的全血
  • 相对于多平台检测更加可靠

CountBright 绝对计数微球是一种经过校准并具有已知浓度的微球悬浮液,可在一系列较宽范围内的激发(紫外至 635 nm)或散射波长(385 至 800 nm)内带有较强的荧光。 对于绝对定量,只需向一定体积的样本中加入一定体积的微球悬浮液,使得样本体积和微球体积之比是已知的。 这样通过微球的数量即可计算的得出分析的样本体积,进而可根据分析的细胞数量确定细胞浓度(图 1)。 通常需要收集1,000个微球数据以保证对于样本体积的确定具有统计学意义。

CountBright 绝对计数微球可以用于任何细胞类型,包括裂解/未经洗涤的全血。 试剂中的微球直径大约7 µm,并且其沉降性质和淋巴细胞相似。 还应避免可能导致细胞或微球损失的样本制备步骤,如洗涤。 CountBright 微球可用于散射或荧光阈值。 当使用散射阈值进行分析时,微球的信号应高于阈值。 微球可以使用单一参数进行分析,但也可以使用多个参数组合以便将微球和细胞及其它微粒区分开。

细胞群定量散点图


图1: Invitrogen CountBright绝对计数微球。
Jurkat 采用Invitrogen LIVE/DEAD 活力/细胞毒性检测试剂盒中的试剂处理活 Jurkat 细胞和热致死细胞。 向样品之中加入Invitrogen CountBright 绝对计数微球 ,然后采用 488 nm 激发光进行流式细胞分析。 采用 530/30 nm 带通滤光片采集钙黄绿素荧光值,采用 610/20 nm 带通滤光片采集的乙啶同型二聚体-1荧光值。 数据显示,活细胞和死细胞清晰以及计数微球可清晰区分。

AccuCheck 计数微珠

  • 采用两种不同颜色微球作为移液精确度的内参
  • 相对于多平台检测,单平台更受青睐并可带来结果的一致性
  • 可通过绝大多数类型的免疫分型实验进行验证

AccuCheck 计数微球是一种有效用于绝对细胞计数的单平台检测方法,将采用两种不同荧光微球(微球A 和 B)的直接流式细胞免疫分型方法的优势进行了结合。 这两种荧光微球可用于血液体积计算的双重内参。 向已知体积经裂解或未洗涤技术处理的染色血液样品中加入相同体积的 AccuCheck计数微球。 微球将会同细胞一起并计数。 由于微球的浓度是已知的,每毫升中细胞数量(绝对技术)可通过将计数得到的细胞数与应该微球 events 的总数通过关联计算出。 随后则可通过每单位体积中总荧光微球的数量相乘而得到相应细胞的数量。 由于 AccuCheck 计数微球系统含有的两种不同荧光微球的比例是已知的,检测过程中便可通过两种微球的比例确认移液的精确度。

LIVE/DEAD BacLight 细菌活性及计数试剂盒

LIVE/DEAD BacLight 细菌活力和计数试剂盒使得研究人员可通过流式细胞仪可靠地区分和定量活/死菌,甚至可处理含有广泛细菌类型的混合菌群(图 2)。 该试剂盒利用两种核酸染料(绿色荧光 Invitrogen SYTO 9 染料和红色荧光碘化丙啶染料)的混合物进行细胞活力测定,并配有用于精确样品体积测量的校准的微球悬浮液。 因此,通过适当的利用SYTO 9和碘化丙啶染料的混合物,具有完整细胞膜的细菌细胞会被染上明亮的绿色荧光,而具有受损细胞膜的细菌细胞则会显示出明显减弱的绿色荧光,并也常常显示红色荧光。 细菌细胞的类型及革兰氏性质会影响死细菌所被染上的红色荧光总量。 SYTO 9和碘化丙啶染料都可以被许多流式细胞仪中的氩离子激光器发射出的488 nm 光谱线有效的激发,并且染料与细菌核酸形成的复合物也能够在绿色和红色通道中被检测出来;背景几乎无荧光。

校准的微球悬浮液被用作样品体积的参考标准。 在这个微球的微球和荧光都已经过精心的挑选,以确保它们能在荧光-侧向散射细胞散点图中,从任何染色的细菌群体中清晰的分辨出来。 一种细菌培养液仅用SYTO9染料和碘化丙啶的最佳混合试剂比例进行染色,然后在利用流式细胞仪进行分析之前,在其中加入固定数量的微球。 活的和死的细菌以及微球都能够非常容易的从荧光-侧散射散点图中区分出来。 然后,活细菌和死细菌的浓度可依据染色后细菌与微球的比率来确定(图15.3.16)。

scatter plots showing quantification of cell populations

图 2. 采用Invitrogen LIVE/DEAD BacLight 细菌活力和计数试剂盒分析细菌培养物。 按照试剂盒操作步骤,活的(未处理的)和死的(乙醇处理的)金黄色葡萄球菌(图A和C)大肠杆菌 (图B和D)的悬浮液与SYTO 9核酸染色和碘化丙啶进行染色,再利用流式细胞仪进行分析。 绿色或红色荧光-侧散射(green or red fluorescence versus side scatter)细胞散点图(图A或B)被用来区分细菌细胞群体与微球群体(分别为左框和右框)。 在每个细胞散点图中的细菌区域的结果又以红色荧光-绿色荧光细胞散点图的形式进行了显示(图C和D)。 每毫升活的和死的细菌浓度可以从荧光-侧散射细胞散点图或绿色荧光-红色荧光细胞散点图中计算得到,其选择取决于哪一个图能更好的将活细胞群体和死细胞群体分开。 活细胞群体和死细胞群体在这些细胞散点图中的位置可能取决于细菌细胞的类型和革兰氏性质。 一些样品的散点结果可能会落在限定的区域以外,这需要进行适当地评价(例如,参见图D)