SuperScript IV One-Step RT-PCR System

让您获得更快、更佳的RT-PCR

即便是难以处理的RNA样本,您将获得比使用其他一步法RT-PCR产品更快速、更轻松地获得更佳结果。Invitrogen™SuperScript™ IV一步法RT-PCR系统整合了性能优异的Invitrogen™ SuperScript™ IV逆转录酶(RT)和Invitrogen™Platinum™ SuperFi™ DNA聚合酶,可在一步法RT-PCR应用中提供无与伦比的实验结果。

产品优势

  • 两步热启动激活机制可实现高产率、高特异性扩增和室温组装反应体系
  • 无与伦比的性能,灵敏度低至0.01 pg RNA,靶序列长度可达13.8 kb, 更快的一步法RT-PCR操作流程
  • 即便是纯度不佳的RNA样本,也可实现可靠的靶点检测
  • 快速、轻松地去除gDNA,让您获得更准确、更可信的实验结果

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SuperScript™ IV一步法RT-PCR系统优势

凭借创新的两步热启动激活机制,SuperScript IV一步法RT-PCR系统与其他商品化试剂盒相比,可达到很高的产物特异性,而且只需一半的反应时间。

快速获得高特异性和高产率。

图 1.快速获得高特异性和高产率。针对HeLa细胞总RNA扩增7.8kb的靶点时,使用SuperScrpt IV一步法RT-PCR系统,SuperScript III一步法RT-PCR系统及Platinum Taq高保真DNA聚合酶,QI、N、QU、T、R、BL——其他供应商的试剂盒进行检测。按照各供应商提供的建议流程进行实验。一步法RT-PCR总反应时间以小时:分钟表示。其他供应商的QI和BL产品未检测出RNA靶点

高灵敏度的SuperScript IV一步法RT-PCR系统可检测出低丰度靶点,即便RNA起始材料有限,也能进行一步法RT-PCR实验。

检测少量RNA起始材料。

图 2.高灵敏度并可信赖的少量RNA起始材料检测。使用SuperScript IV一步法RT-PCR系统对范围广泛的起始量HeLa细胞总RNA材料进行0.35 kb的RNA靶点检测。

由于SuperScript IV RT和Platinum SuperFi DNA聚合酶具有很高的持续合成能力,SuperScript IV一步法RT-PCR系统可检测的靶点长度范围很大。

适用于检测大范围的靶点长度
图 3.适用于检测大范围的靶点长度。使用SuperScript IV一步法RT-PCR系统检测0.2至13.8 kb的人RNA片段。

SuperScript IV一步法RT-PCR系统可耐受常见RT和PCR抑制剂(如与样本一起纯化出来的化合物或者RNA纯化时所用的试剂) 的影响。这种出众的稳定性使该系统获得的可靠结果较少依赖于RNA样本的质量。

耐受抑制剂

图 4.耐受抑制剂。使用SuperScript IV一步法RT-PCR系统或其他商品化一步法RT-PCR试剂盒从HeLa细胞总RNA中检测1 kb的RNA靶点,各反应混合物所含抑制剂如下:
1–无抑制剂
2–肝素 (0.18 µg/µL)
3–木聚糖 (2.5 µg/µL)
4–腐殖酸 (0.02 µg/µL)
5–LiCl (2 µg/uL)。
所有试剂盒均受到即使是痕量的抑制剂的抑制。

SuperScript IV一步法RT-PCR反应体系在室温下可长时间保持稳定,适用于高通量实验。

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图 5.室温下长时间保持稳定。使用SuperScript IV一步法RT-PCR试剂分别与1 pg和10 pg HeLa细胞总RNA组成一步法RT-PCR反应体系,热循环前在室温下放置长达4小时。即便室温下经过4小时,仍可实现高效、高特异性的靶点扩增。NTC:无模板对照。
  • RNA纯化方法(包括柱法DNA酶消化方法)往往无法彻底去除gDNA。对污染的gDNA进行扩增会导致非特异性或误导性的一步法RT-PCR结果。
  • 传统方法使用DNA酶I去除gDNA污染,此方法包含非常耗时的DNA酶灭活或去除步骤,并且后者的反应条件会损伤RNA,影响实验结果。
  • 全新的SuperScript IV一步法RT-PCR系统(含ezDNase)可高效、快速、温和 (37°C下5分钟) 地去除RNA样本中的gDNA,确保获得最准确、最可信的一步法RT-PCR结果。
superscript iv ezDNase
SuperScript IV One-Step RT-PCR System with ezDNase Enzyme

SuperScript IV一步法RT-PCR系统具有高效的扩增能力,能够在同一个多重一步法RT-PCR反应中高效、特异性扩增多个靶目标 。 

multiplex

图 6.使用SuperScript IV一步法RT-PCR系统可同时扩增高达4个靶标。使用Hela细胞 RNA作为模板,扩增一至多个长度逐渐增加的靶标(528, 997, 3,009和4,497) 。

常见问题

The optimal annealing temperature for your primers may differ significantly when using the SuperScript IV One-Step RT-PCR System in comparison to other one-step RT-PCR products due to differences in buffer salt concentration.Always use the Tm calculator (thermofisher.com/tmcalculator) to determine your primers’ Tm values and recommended annealing temperature.

The RT-PCR cycling conditions with the SuperScript IV One-Step RT-PCR System differ significantly from other one-step RT-PCR products.For the best results, always use cycling conditions described in the SuperScript IV One-Step RT-PCR System manual.

Good laboratory practices are important for long fragment, one-step RT-PCR.These include using high-quality templates (pure, fresh, and intact) and fresh primer solutions.Optimization steps to consider include longer extension times as recommended in the protocols and increasing template amounts.Learn more about RT-PCR reaction optimization and setup by visiting our reverse transcription educational resources.

With the SuperScript IV One-Step RT-PCR system, cDNA synthesis can be performed at higher temperatures than with other one-step RT-PCR products.For GC-rich or structurally complex RNA templates, it is recommended to increase the cDNA synthesis incubation temperatures up to 55–60 °C.

The two-phase hot-start mechanism ensures sequential activation of RT and PCR enzymes in the one-step RT-PCR workflow.At ambient temperature, SuperScript IV RT is maintained inactive with a heat-sensitive RT-blocker.During the first hot-start activation phase at approximately 45°C, the RT-blocker is released and the first-strand cDNA synthesis is initiated.During the second activation phase, the reaction is heated to 98°C to activate Platinum SuperFi DNA Polymerase and simultaneously inactivate SuperScript IV RT.This mechanism separates the RT and PCR enzymes’ activities, delivering the highest RT-PCR specificity and yield.

Platinum SuperFi DNA Polymerase in the SuperScript IV One-Step RT-PCR System produces blunt-end PCR products that can be cloned directly into blunt-end cloning vectors.TA cloning is also possible if 3′ dA-overhangs are added after PCR.Learn more about the use of different PCR enzymes for cloning application by visiting PCR educational resources.

资源

操作手册

工具

Tm 计算器
Platinum SuperFi DNA聚合酶的退火温度设计规则和许多普通的DNA酶(如TaqDNA酶)不一样。使用SuperScript IV 一步法RT-PCR系统时,建议使用我们网站的Tm计算器,确保获得更佳的一步法RT-PCR结果。

白皮书

Reverse transcription technical resources

Learn about the reverse transcription basics, setup considerations, importance of enzyme polymerase choice, common methods and applications, and troubleshooting.