您不必提取RNA来分析基因表达。采用Cells-to-CT™方法,您只需简单地将细胞裂解成裂解液(最少量的操作),然后就可用于下游的RT-PCR,而无需进行RNA纯化。

在本视频中,高级研发经理Richard Fekete博士将就与从直接裂解方法到RNA分析和RT-qPCR相关的典型问题进行简短的解答。


  在定量PCR前,可以直接在48孔、24孔或6孔培养板里直接裂解细胞吗?- 0:32    

可以用冻存的或保存在RNAlater里的细胞吗?-0:24

 


             
  细胞裂解产物可以保存在-80度吗?能保存多长时间?- 0:22    

可以直接裂解未经培养的原代细胞或其它细胞系的细胞吗? - 0:32

 

 

             
  可以自动化操作快速裂解步骤吗? - 0:27    

可以处理肝素或EDTA抗凝的血标本吗?- 0:27

 

 

 

             

 

  这个试剂能同时提取DNA和RNA吗? - 0:26     快速裂解法也可以用于裂解组织样品吗?- 0:20
             
  怎么知道我的RT反应系统是不是被一些因子抑制? - 0:24     怎么用裂解产物分析RNA的质量? - 0:24
             
  快速裂解法适用于病毒RNA的提取吗? - 0:19     快速裂解法适用于细菌RNA的提取吗? - 0:24

             
 

在短视频中回答DNA/RNA分析直接裂解策略问题的是Life Technologies公司研发部的Mu Li, Ph.D Scientist III

  1.在定量PCR前,可以直接在48孔、24孔或6孔培养板里直接裂解细胞吗?    2.可以用冻存的或保存在RNAlater里的细胞吗?
       
  3.细胞裂解产物可以保存在-80度吗?能保存多长时间?     4.可以直接裂解未经培养的原代细胞或其它细胞系的细胞吗?
       
  5.可以自动化操作快速裂解步骤吗?     6.可以处理肝素或EDTA抗凝的血标本吗?
       
  7.这个试剂能同时提取DNA和RNA吗?     8.快速裂解法也可以用于裂解组织样品吗?
       
  9.怎么知道我的RT反应系统是不是被一些因子抑制?     10.直接裂解法对微量的样品是不是一个好的选择?
       
  11.怎么用裂解产物分析RNA的质量?     12.快速裂解法适用于病毒RNA的提取吗?
       
  13.快速裂解法适用于细菌RNA的提取吗?        

 

1). 已测试过哪些细胞系?

以下是与Cells-to-CT™系统兼容的细胞系简要清单:

细胞系 培养方式 种源 组织来源
HeLa 贴壁培养 人源 宫颈腺癌
HepG2 贴壁培养 人源 肝癌
Primary Hepatocytes 贴壁培养 人源 肝脏
SK-N-AS 贴壁培养 人源 脑成神经细胞
SK-N-SH 贴壁培养 人源 脑成纤维细胞
U-87 MG 贴壁培养 人源 脑胶质母细胞瘤
ME-180 贴壁培养 人源 宫颈表皮样癌
A549 贴壁培养 人源 肺癌
Jurkat 悬浮培养 人源 急性T细胞白血病
PC-12 贴壁培养 褐家鼠(鼠) 肾上腺嗜铬细胞瘤
PT-K75 贴壁培养 猪科动物(猪) 鼻甲粘膜
NIH/3T3 贴壁培养 小家鼠(小鼠) 胚胎成纤维细胞
Raji 悬浮培养 人源 B淋巴细胞
HEK-293 贴壁培养 人源 肾脏
COS-7 贴壁培养 绿猴(猴) 肾脏
CHO-K1 贴壁培养 葛利斯鼠(仓鼠) 卵巢
NCI-H460 贴壁培养 人源
DU-145 贴壁培养 人源 前列腺
K562 悬浮培养 人源 骨髓
U-2 OS 贴壁培养 人源
Huh-7 贴壁培养 人源 肝脏
Neuro 2A 贴壁培养 小家鼠
BJ 贴壁培养 人源 包皮

2). 是否适用于我的特殊细胞系?

Cells-to-CT™系统没有理由不适用于某种细胞系。(请参阅上述已测试确认可兼容的细胞系表)。然而,由于在细胞大小和组成的差异,对于不同的细胞系,每次裂解反应的细胞的最大数量可能略有不同。可使用TaqMan® Cells-to-CT™ Control Kit测试抑制效果及最小样品量.

3).  为什么说这是标准纯化方案的“绿色”替代方案?

浪费少,危险低 - 通过10个样品的比较

RNeasy™
35分钟
140 g 塑料垃圾
18 mL有害垃圾
Cells-to-CT™
7分钟
6.6 g 塑料垃圾
0 mL有害垃圾

4).  如何去除Cells-to-CT™中的痕量gDNA?

  1. 确保去除每个孔中的所有培养基.
  2. 除去培养基后,用等体积常温1X PBS冲洗.
  3. 确保所有反应在室温下进行(如果板子在冰上,或加入预冷的裂解溶液,则裂解反应可能不会达到室温,需要迅速移动到实验台).
  4. 加热裂解溶液至常温,再加入细胞.
  5. 让裂解反应进行8分钟.
  6. 在25°C下进行长达8分钟的裂解反应.